[发明专利]一种MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系及其构建方法

摘要

本发明公开了一种MDCK‑MDR1的药物吸收筛选体系及其构建方法，针对MDCK细胞中犬P‑gp基因设计出了sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体；将人源MDR1基因转染至MDCK‑KO细胞中，筛选扩大阳性单克隆；蛋白免疫印迹法检测p‑gp蛋白表达，成功表达者即表示MDCK‑MDR1的药物吸收筛选体系构建成功。本发明基于工程技术敲除MDCK细胞中犬P‑gp蛋白的基因，以背景完全“干净”的MDCK细胞作为宿主细胞构建稳定表达人源p‑gp蛋白的MDCK‑MDR1细胞系，从而完善MDCK‑MDR1作为血脑屏障药吸收、转运筛选模型的功能。

主权项

1.一种MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、针对MDCK细胞中犬P-gp基因设计出了sgRNA，用于靶点基因敲除；(2)、以U6启动子表达sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体；(3)、在对数生长期的野生型MDCK细胞中，加入sgRNA表达载体和GenJet形成的转染复合物，37℃反应20min，加入新鲜培养基，48h后以1：3比例传孔，第二天加800ug/ml的G418进行筛选，大量细胞死亡，停止加药，待细胞进入对数生长期后铺单克隆，每3天换药一次，待细胞大量死亡，降低G418筛选浓度至200μg/ml或撤除G418，15天左右待细胞单克隆长至0.5cm左右进行挑取筛选阳性单克隆；(4)、取阳性单克隆菌株，生长至对数生长期后，调整细胞浓度至1×105个/ml，加入到6孔板中，每孔2ml，24h后进行质粒转染，2μg人源MDR1质粒+5ul脂质体+700ul优化液加到MDCK-KO细胞表面，6h后弃去转染液，加入新鲜培养基孵育48h；加入含G418(800ug/ml)进行筛选，8-10天后，绝大部分细胞死亡，将存活的细胞消化后接种到96孔板中进行单克隆筛选，待单克隆形成后扩大培养；(5)、蛋白免疫印迹法检测p-gp蛋白表达，成功表达者即表示MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系构建成功。