[发明专利]一种线性多泛素基因的连接方法

摘要

本发明提供一种连接多泛素基因的方法，提供了优化的泛素（ubiquitin、Ub）基因作为多泛素基因连接的基本单位，用于表达载体的构建，同时本方法利用泛素基因的3’端核苷酸序列的特殊性来设计特殊的平末端酶切位点，并通过平末端限制性核酸内切酶stuI的特殊性将泛素基因连接成一个串联基因。线性多泛素分子可作为细胞内修饰靶蛋白并参与免疫调节的蛋白因子，具有非常广阔的研究及应用前景。本发明中涉及的多泛素基因的连接方法能够快速制备出所需长度泛素的基因，具有工艺简单、安全无毒，成本低等优点。

主权项

1.一种线性多泛素基因的连接方法，包括以下步骤；1）设计优化单泛素基因序列；根据泛素的氨基酸序列与大肠杆菌密码子偏好性，设计优化单泛素基因序列的密码子频率、GC含量、mRNA二级结构、重复序列、酶切位点等性质，并去除终止密码子；设计单泛素基因的3’ 端末位三个碱基为GGC，作为stu I识别位点的前三个碱基，在此序列的3’ 端添加stu I识别位点的后三个碱基 ( CTA )，即为stu I的识别位点，并于此位点后添加一段编码柔性氨基酸的碱基序列和Hind III酶切位点以便于后续的连接以及蛋白纯化；2）优化的单泛素基因连接单位的获取：以优化单泛素基因序列为模板设计引物，利用设计的引物运用PCR的方法扩增出所需的单泛素基因连接单位Ub‑linker与c‑Ub‑linker；3）单泛素基因连接单位与原核表达载体的初步连接；PET22b原核表达载体、Ub‑linker进行双酶切（NdeⅠ、Hind Ⅲ）后，利用T4 DNA连接酶进行连接，获得连接成功的线性单泛素基因；4）线性多泛素与原核表达质粒的连接方法：将c‑Ub‑linker、线性单泛素基因进行双酶切（stuⅠ、Hind Ⅲ）后，利用T4 DNA连接酶进行连接，获得连接成功的线性泛素基因。