[发明专利]一种NK细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种NK细胞的制备方法，经过培养瓶包被、外周血采集、单个核细胞的分离、接种、扩增和细胞收获步骤，完成NK细胞的制备；本发明的提供的无血清培养基成分明确，安全性高，单个核细胞经过该培养基培养激活后，扩增能力强，经过15‑18天的培养，扩增160‑200倍，经流式细胞仪检测，CD3‑CD56+的NK细胞含量为65‑70%，CD3+CD56+的NK样T细胞含量为5‑15%，NK和NKT细胞的含量超过75%，对K562的杀伤活性在201的效靶比时达到了85%以上，另外本发明中的扩增方法简单，高效，有利于规模化生产。

主权项

一种NK细胞的制备方法，其特征在于：经过培养瓶包被、外周血采集、单个核细胞的分离、接种、扩增、细胞收获和鉴定步骤，完成NK细胞的制备；具体步骤如下：（1）培养瓶包被：1 mg/ml人源化CD16单抗和1 mg/ml OKT‑3单抗，用pH 7.6‑8.2的无菌DPBS梯度稀释抗体至所需浓度，包被T75瓶，每瓶10 ml，4℃过夜或37℃预包被1 h，最优浓度为3 ug/ml人源化CD16单抗和2 ug/ml OKT‑3单抗；（2）外周血采集：客户经三甲医院检测HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体的检测项目均为阴性；由专业护士抽取50‑80 ml外周血，放于含有肝素锂抗凝剂的10 ml无菌采血管内，4℃保存，12 h内分离；（3）单个核细胞分离：向50 ml离心管内预先加入15‑20 ml淋巴分离液，再缓慢加入25‑30 ml混匀的外周血液，离心，然后收集上层血浆水浴灭火，吸取白膜层细胞放置到50 ml离心管中，抽取计数样本，补充盐水到50 ml，1500‑2000 rpm转速下，离心10 min，重复离心2次；（4）接种：细胞以1‑2×106/ml的密度接种到预先包被的T75培养瓶中，加入20 ml无血清培养基和5%的自体血浆，进行接种培养；（5）扩增:第3‑4天加入等量的无血清培养基，之后每2‑3天根据细胞密度加入1‑2倍体积的无血清培养基和0‑3%的自体血浆，当培养体系超过100 ml时转入T‑610培养袋继续培养，所述细胞密度控制在2‑3×106/ml，培养终体系为2000 ml；（6）细胞收获和鉴定：经过15‑18天的扩增，细胞密度达到3‑4×106/ml时，将细胞悬液经过2000 rpm转速下，10 min离心后，收集底部细胞沉淀，离心前收集细胞悬液用于计数、活力和流式检测，离心后上清用于菌检，内毒素、支原体检测，细胞用于冻存或其它用途，具体鉴定步骤如下：a)细胞增殖能力：分别在第0、4、8、12、16天取培养的细胞，用台盼蓝染色计数后，用当天细胞总数除以第0天的细胞数，得到扩增倍数；b)NK细胞的表型：取D16天的NK细胞，以DPBS缓冲液制备成浓度为1×108个/ml的细胞悬液,取100 ul细胞悬液放于1.5ml EP管中，分别加入CD3‑FITC和CD56‑PE抗体各20 ul，4℃避光孵育30 min，加入400 ul的DPBS，1500 rpm 离心6 min，弃上清，加入500 ul DPBS混匀后转移到流式上机管中，上机检测；c)NK细胞的杀伤活性：以处于对数生长期的人白血病细胞K562为靶细胞，将扩增的NK细胞作为效应细胞，采用LDH法检测NK细胞的杀伤活性，具体为按1:1、10:1、20:1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合，同时设置效应细胞孔、靶细胞孔，用酶标仪检测450 nm时的OD值；杀伤率计算公式为：杀伤率=[1‑(实验孔OD值‑效应孔OD值/靶细胞孔OD值)]×100%，实验孔为含有效应细胞和靶细胞的孔；经过此6步即完成了NK细胞的制备。