[发明专利]一种蓝猪耳遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种蓝猪耳遗传转化方法，该方法涉及遗传工程技术领域，具有操作简单，能快速有效的获得转基因植株的特点。该方法在传统的农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化中，加入了表面活性剂——Silwet L‑77，降低了叶片表面张力，使农杆菌充分接触叶片伤口，获得了较高的遗传转化效率。由于传统的遗传转化多采用叶盘诱导丛生芽来获得转基因株系，获得的抗性苗阳性率低，本方法利用愈伤诱导丛生芽的方法获得转基因苗，大大增加了阳性率。本方法对传统的遗传转化过程进行了优化，缩短了转化周期，获得了可稳定遗传的转基因植株，这个优良的转化系统为应用基因工程手段研究被子植物双受精的细胞与分子机制奠定基础。

主权项

1.一种蓝猪耳遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括：(1)共培养阶段：将蓝猪耳无菌苗叶片剪成边长小于1cm的小片后，放入到OD600＝0.7的菌液中5min；所述菌液中含有0.01％(v/v)Silwet L-77、20μmol/LAS；然后将叶片转移至共培养培养基中23～25℃避光培养4～7天；共培养阶段所用的固体培养基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；2,4-D 0.1mg/L；AS 200μmol/L；(2)愈伤诱导阶段：将步骤1共培养之后的材料转移至愈伤诱导培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养，培养三周；愈伤诱导培养基基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；2,4-D0.1mg/L；Kan200mg/L；Cef 300mg/L；(3)芽诱导阶段：将步骤2获得的抗性愈伤组织转移至芽诱导培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养7天，诱导出抗性芽，芽诱导培养基成分是：1/2MS；6-BA1.0mg/L；IAA 0.1mg/L；Cef 300mg/L；(4)抗性芽筛选阶段：将步骤3培养后的材料转移至筛选抗性芽培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养三周，得到2～3cm高的墨绿色小苗；抗性芽培养基培养基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；IAA 0.1mg/L；Kan 200mg/L；Cef 300mg/L。(5)生根阶段培养：将步骤4的墨绿色小苗剪下，扦插至生根培养基，待小苗长至4～6cm即可炼苗，移栽至花盆，生根培养基成分是：1/2MS；IAA0.4mg/L；Kan 50mg/L。