[发明专利]一种用于检测胶基型嚼烟对细菌回复突变数影响的方法

摘要

本发明涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细菌回复突变数影响的方法，属于烟草及烟草制品安全性生物学评价技术领域。该方法包括样品前处理、增菌培养、受试菌浓度确定、S9混合液的配制、受试物的制备、受试物的培养、结果判定等步骤。本发明综合考察胶基型嚼烟的溶出方式、暴露途径、作用方式，建立了胶基型嚼烟样品前处理方法并制定了样品检测剂量，形成了适合胶基型嚼烟的细菌回复突变试验检测方法，具有良好的应用前景。

主权项

一种用于检测胶基型嚼烟对细菌回复突变数影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；步骤（2），增菌培养：取无菌营养肉汤培养基，将TA98和TA100菌株分别接种于营养肉汤培养基内，于37℃下振荡培养，得菌液；步骤（3），受试菌浓度确定：用紫外分光光度计测定步骤（2）的菌液在600nm下的OD值，再用无菌营养肉汤培养基将菌液稀释至OD值为0.3，得到检测用菌液；步骤（4），S9混合液的配制：制备体积百分浓度为10%的S9混合液备用；步骤（5），受试物的制备：受试物分为四个体系：TA98(+S9)、TA98(‑S9)、TA100(+S9)和TA100(‑S9)，每个体系均分为四组，自发回变组、溶剂对照组、阳性对照组和样品测试组；其中，每个体系的样品测试组的受试物的制备方法为：在不同的培养皿内加入PBS和不同剂量的步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为12.5%、25%、50%、100%，得到四个浓度的样品测试组的受试物，终体积为1000μl/皿；每个体系的自发回变组的受试物为空白；每个体系的溶剂对照组的受试物为PBS，体积为1000μl/皿；TA98(+S9)体系的阳性对照组的受试物的制备方法为：将100 μl/皿 TA98菌液、500μl/皿 体积百分浓度为10%的S9混合液和10 μg/皿 2‑氨基芴混合均匀，即得；TA98(‑S9)体系的阳性对照组的受试物为的制备方法为：将100 μl/皿 TA98菌液和10 μg/皿2‑硝基芴混合均匀，即得；TA100(+S9)体系的阳性对照组的受试物为的制备方法为：将100 μl/皿 TA100菌液、500μl/皿体积百分浓度为10%的S9混合液和10 μg/皿 2‑氨基芴混合均匀，即得；TA100(‑S9)体系的阳性对照组的受试物为的制备方法为：将100 μl/皿 TA100菌液和10 μg/皿叠氮钠混合均匀，即得；步骤（6），受试物的培养：将各受试物分别加入到2.0mL、40℃水浴保温的含0.6%（W/V）琼脂的顶层培养基中，混匀后迅速倒入培养皿的含1.8%（W/V）琼脂的底层培养基上，转动皿使顶层培养基均匀分布在底层培养基上，平放固化，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养48h；步骤（7），结果判定：观察步骤（6）的培养后培养皿，分别计数阳性对照组、自发回变组、溶剂对照组和受试样品组培养基上长出的回复突变菌落数，阳性对照组和自发回变组菌落数在如表1所示的正常范围内，且溶剂对照组诱发的回复突变菌落数与自发回变组回复突变菌落数无显著差异，则表明试验体系正常，试验有效；反之，则试验无效，需重新按照步骤（1）‑步骤（6）进行试验；表1阳性对照组和自发回变组菌落数正常范围在试验有效的情况下，如样品测试组的回复突变菌落数等于大于自发回变组回复突变菌落数的2倍以上，且样品测试组的剂量与样品测试组的回复突变菌落数相之间有剂量反应关系的，即为阳性结果，该胶基型嚼烟会影响细菌回复突变数；反之为阴性结果，该胶基型嚼烟不会影响细菌回复突变数。