[发明专利]一种检测胶基型嚼烟对细胞早期凋亡影响的方法

摘要

本发明涉及一种检测胶基型嚼烟对细胞早期凋亡影响的方法，属于烟草及烟草制品安全性生物学评价技术领域。该方法包括样品前处理、单细胞悬液的制备、单细胞悬浮液的细胞浓度计算、受试物暴露、孵育受试物、收集细胞、洗涤细胞、细胞早期凋亡影响率的计算等步骤。本发明综合考察胶基型嚼烟的溶出方式、暴露途径，建立了胶基型嚼烟样品前处理方法，对样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测胶基型嚼烟对细胞早期凋亡的影响。

主权项

一种检测胶基型嚼烟对细胞早期凋亡影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO₂培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm²生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至1.0×10⁵个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO₂培养箱内培养24h；步骤（5），受试物暴露：受试物分为两组：细胞对照组和样品测试组；移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组；在细胞对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基；在样品测试组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和不同剂量步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度在大于0%、小于等于60%的范围内；细胞对照组和样品测试组的终体积为2mL/孔；步骤（6），孵育受试物：将步骤（5）加样后的细胞培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育24h；步骤（7），收集细胞：每孔分别收集细胞，具体的收集方式为：首先收集步骤（6）中的培养液，之后贴壁细胞用不含EDTA的0.25%的胰酶消化后连同收集的培养液一起于4℃下离心，弃上清液，收集细胞；步骤（8），细胞早期凋亡影响率的计算：步骤（7）每孔所收集的细胞用预冷至4℃的PBS洗涤后，再加入100μL的Binding Buffer重悬细胞，加入5μL的Annexin V‑FITC和5μL的PI染料，混匀，然后在避光、室温下反应10min，再加入400μL的Binding Buffer进行混匀得到检测样品，在1小时内用流式细胞仪检测，即得到细胞早期凋亡影响率；将样品测试组的细胞早期凋亡影响率与细胞对照组的细胞早期凋亡影响率相比，如无显著差异，则为阴性结果，该胶基型嚼烟对细胞不会引起细胞凋亡；如有显著差异，且样品测试组的剂量与样品测试组的细胞早期凋亡影响率之间有剂量效应关系，需重复步骤（1）‑步骤（7），如仍有显著差异且有剂量效应关系即可确认为阳性结果，该胶基型嚼烟会引起细胞凋亡；反之，则为阴性结果，该胶基型嚼烟不会引起细胞凋亡。