[发明专利]一种基于荧光探针的新型基因SNP分型方法

摘要

本发明是一种基于荧光探针的新型基因SNP分型方法，(1)模板DNA提取：采用DNA提取试剂盒进行模板DNA的提取；(2)FH‑PCR第一阶段：目的片段扩增；(3)FH‑PCR第二阶段：溶解曲线信号收集；(4)结果判读。本发明提供了一种新型探针，实现一条探针即可检测一个SNP位点；优化了PCR反应体系和配方，提高检测的准确度；改进了荧光定量PCR的流程，提高了荧光定量仪利用度；优化了反应流程，提高了基于探针法和荧光定量PCR仪的SNP检测产量。

主权项

1.一种基于荧光探针的新型基因SNP分型方法，其特征在于，具体步骤为(1)模板DNA提取：采用DNA提取试剂盒进行模板DNA的提取；(2)FH-PCR第一阶段：目的片段扩增①PCR扩增体系成分包括：Taq HS DNA聚合酶；Taq HS DNA聚合酶10X缓冲液；荧光探针；上游引物；下游引物；模板DNA；由dATP、dCTP、dGTP和dTTP组成的4种dNTP混合物；高纯水；②PCR扩增体系的配制：将1Unit的Taq HS DNA聚合酶、Taq HS DNA聚合酶10倍浓度的缓冲液、0.05-0.5uMol/L的上游引物和下游引物、0.2uMol/L的荧光探针、0.2mMol/L的4种dNTP混合物在体系配制专区进行配制；在另外一个专区进行模板DNA的添加，模板DNA的添加量为10-100ng，最后用高纯水补足至20uL；③扩增在普通PCR仪上进行目的片段的扩增；PCR引物与基因组DNA结合，经过PCR循环，以半保留复制的形式，实现指数级扩增；各个步骤及控制参数如下：第一步，温度为95℃、循环数为1，时间为3分钟；第二步，温度为95℃、循环数为50，时间为15秒；第三步，温度为60℃、循环数为50，时间为20秒；第四步，温度为72℃、循环数为50，时间为20秒；第五步，温度为95℃、循环数为1，时间为1分钟；第六步，温度为40℃、循环数为1，时间为1分钟；第七步，温度为4℃、循环数为1；(3)FH-PCR第二阶段：溶解曲线信号收集将扩增完的PCR的反应板直接放置在荧光定量PCR仪上进行反应，根据检测的荧光探针基因团的数目，选择荧光通道模式，不需开盖；各个步骤及控制参数如下：第一步，温度为40℃、循环数为1，探针与目的片段结合，时间为3分钟；第二步，温度为50℃逐渐升高到85℃，循环数为1，探针与目的片段解离，形成2级结构，在这个过程中收集荧光信号，得到溶解曲线；第三步，温度为95℃、循环数为1，时间为30秒；第四步，温度为25℃、循环数为1；(4)结果判读：根据设计的荧光探针的类型，如果目的片段的多态性与设计的吻合，且为纯合型，则溶解曲线Tm值为高温型，显示的峰型为单一峰；如果目的片段的多态性与设计的不吻合，且为纯合型，则溶解曲线Tm值为低温型，显示的峰型为单一峰；如果是杂合型，则溶解曲线会出现两个峰型。