[发明专利]一种梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法

摘要

本发明提供一种梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法，涉及分离培养细胞领域。为解决培养梅花鹿瘤胃上皮细胞纯度低，活力低，成功率低，易污染等问题，本发明提供的方法步骤如下：取梅花鹿瘤胃组织，用含有抗生素等的PBS缓冲液冲洗；取上皮组织剪碎，加入含有胎牛血清FBS、亚硒酸钠、抗生素等的DMEM/F12培养液贴壁培养；加入含有胎牛血清FBS、亚硒酸钠、抗生素等的DMEM/F12培养液传代培养。按照本发明提供的方法能够首次成功分离出梅花鹿瘤胃上皮细胞，纯度及活性较高并可稳定传代，并且克服了瘤胃内多种微生物带来的污染问题。本发明可应用于梅花鹿瘤胃上皮的生长发育、生理功能及在营养代谢等方面的研究。

主权项

1.一种梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法，其特征在于：步骤如下：(1)取梅花鹿瘤胃组织，先将瘤胃内容物用生理盐水清洗干净后，再用含有青霉素、链霉素、庆大霉素、两性霉素B的PBS缓冲液冲洗6-8遍，最后一遍冲洗后，再加入PBS缓冲液并静止10min；(2)将瘤胃组织的肌层及上皮层分离，取上皮组织备用；(3)将上皮组织剪碎，将剪碎的组织均匀平铺在培养瓶中，倒置在培养箱中放置2h；(4)加入含有胎牛血清FBS、EGF、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素、庆大霉素、两性霉素B的DMEM/F12培养液中进行贴壁培养；(5)贴壁培养4天后，弃去培养液，加入含有胎牛血清FBS、EGF、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素的DMEM/F12培养液，继续培养，每隔4-5天换培养液，所述换培养液操作为保留原培养液的1/3-1/2，加入与弃去培养液体积相同的含有胎牛血清FBS、EGF、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素的DMEM/F12培养液；细胞铺满培养瓶底部80％以上时的细胞作为第零代细胞；(6)第零代细胞弃去培养液，用PBS缓冲液冲洗后加入胰蛋白酶进行消化，当在显微镜下观察细胞变圆时，加入与胰蛋白酶等体积的含FBS5-10％(v/v)的DMEM/F12培养液终止消化，将贴壁的细胞吹打成悬液，1000r/min离心5分钟弃上清，加入适量的含有FBS、EGF、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素的DMEM/F12培养液吹打重悬，分成三等分分别补加同样的培养液分别进行培养，在37℃培养箱里静止30min后，将培养液吸出至另一培养皿中，利用上皮细胞与成纤维细胞贴壁时间不同的方法纯化细胞，此操作重复3次后补加相同的培养液进行培养，可得到纯化的梅花鹿瘤胃上皮细胞；细胞铺满培养瓶底部80％以上时的细胞可进行下一次传代。