[发明专利]一种柠檬酸对小鼠胰岛素抵抗形成的影响的实验方法

摘要

本发明公开了一种柠檬酸对小鼠胰岛素抵抗形成的影响的实验方法，该方法包括以下步骤：步骤1、动物分组及给药；步骤2、口服糖耐量实验；步骤3、动物的处死；步骤4、生化试验及生理切片；步骤5、RT‑PCR；步骤6、统计学分析。本发明对纯品柠檬酸做了研究，在同时灌胃柠檬酸和高脂乳剂的情况下，通过检测血脂、胰岛素敏感指数、相关基因的表达以及靶器官组织细胞形态变化，探讨柠檬酸是否能缓减或抑制小鼠产生胰岛素抵抗，为后续野山杏总有机酸的研究提供一定依据。 1

主权项

1.一种柠檬酸对小鼠胰岛素抵抗形成的影响的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、动物分组及给药

昆明种小鼠，60只，雌雄对半，体重20±2g，由新疆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK新2016‑0003；适应性饲养1周后，小鼠随机分为6组，每组10只，即正常对照组，高脂血症模型组，阳性对照组给予血脂康及柠檬酸CA高、中、低剂量组；正常对照组每日灌服相应体积的质量分数为0.5％CMC‑Na溶液，其他组于每日上午均灌服剂量为20mL·Kg^‑1·d^‑1高脂乳剂；下午正常组和模型组自由饮水进食，阳性对照组灌服血脂康200mg·Kg^‑1·d^‑1，CA高、中、低剂量组分别给予100、50、10mg·Kg^‑1·d^‑1，连续给药4周，给药期间，自由进水，进食；

步骤2、口服糖耐量实验

于实验第28天，禁食12h，尾部采血测空腹血糖；给予Control组灌胃0.5％CMC‑Na、HFE组灌胃高脂乳剂、血脂康组灌胃200mg g·kg^－1的血脂康及CA+HFE组灌胃高脂乳剂和不同剂量的柠檬酸，20min后各组小鼠灌胃2500mg·kg^－1的葡萄糖，测定0、15、30、60、120min的血糖值，并计算各组120min内的血糖曲线下面积；

步骤3、动物的处死

于实验第30天，禁食12h，眼眶采血，制备血清，用于测定血清生化指标，快速解剖，取肝脏、骨骼肌，用于基因测序；

步骤4、生化指标测定

用TC、TG、HDL‑C和LDL‑C测定试剂盒分别测定血清中TC、TG、HDL‑C及LDL‑C的含量；用小鼠ELISA试剂盒检测血清中胰岛素的含量，并计算胰岛素敏感指数及胰岛素抵抗指数

步骤5、RT‑PCR

使用Trizol提取样品总RNA，Oligo dT Primer或dNTP Mixture将RNA反转录成cDNA；根据基因序列设计特异性引物，引物的核苷酸序列如SEQ:ID:NO:1‑SEQ:ID:NO:6所示，通过实时荧光定量PCR，采用SYBR GREEN染料法，以actin为内参基因，做相对定量检测，并用2^‑△△Ct法对数据进行相对定量分析；

步骤6、统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，实验结果以x^‑±s表示，组间差异的比较用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学意义。

2.根据权利要求1所述的柠檬酸对小鼠胰岛素抵抗形成的影响的实验方法，其特征在于，与control组相比HM组血清的TG、TC和LDL‑C，含量显著升高，P<0.01，HDL‑C含量显著降低，P<0.01，说明高血脂模型的建立是成功的；与HM组相比CA组和血脂康组，血清TG、TC、LDL‑C均明显降低，P＜0.05，HDL‑C的含量显著升高，P＜0.01，说明CA具有降低血脂的作用。

3.根据权利要求1所述的柠檬酸对小鼠胰岛素抵抗形成的影响的实验方法，其特征在于，与control组相比HM组空腹及灌糖2h后的血糖值明显高于control组，P<0.01，说明在高血脂症小鼠组织对糖的利用率降低和糖代谢存在异常；与HM组相比CA组和血脂康组空腹及灌糖2h后的血糖值，均显著降低，P<0.01，并恢复到和control组相当的水平，说明CA有调节小鼠糖代谢使之恢复正常的作用。

4.根据权利要求1所述的柠檬酸对小鼠胰岛素抵抗形成的影响的实验方法，其特征在于，与control组相比HM组的血糖GAUC显著增大，P<0.01，说明高血脂症小鼠对糖的代谢作用降低；与HM组相比CA组和血脂康组的血糖GAUC有显著减小，P<0.01，并且CA组的血糖GAUC与control组相比无明显差异，说明CA能够促进机体对糖的代谢作用，恢复到control组的水平。

5.根据权利要求1所述的柠檬酸对小鼠胰岛素抵抗形成的影响的实验方法，其特征在于，与control组相比HM组的FINS和HOMA‑IR明显升高，P<0.01，ISI水平显著降低，P<0.01，说明高血脂症小鼠机体产生了胰岛素抵抗，对胰岛素敏感性降低了；与HM组相比CA组和血脂康组的FINS和HOMA‑IR明显降低，P<0.05，ISI水平显著升高，P<0.05，说明使用CA干预后，减弱了机体的胰岛素抵抗和增加了对胰岛素的敏感性，与control组相比CA组无明显差异，说明机体对胰岛素的敏感性恢复到了正常状态。

6.根据权利要求1所述的柠檬酸对小鼠胰岛素抵抗形成的影响的实验方法，其特征在于，与control组相比HM组肝脏G‑6‑Pase m RNA的表达量，明显升高，P＜0.01，说明高血脂症小鼠对糖的利用率降低了并增加了肝脏糖异生；与HM组相比CA组和血脂康组，肝脏G‑6‑Pase m RNA的表达量明显下调，P＜0.05，说明CA提高了小鼠机体对糖利用的同时抑制了糖异生；CA组与control组相比无明显差异，说明糖代谢恢复到了正常水平。

7.根据权利要求1所述的柠檬酸对小鼠胰岛素抵抗形成的影响的实验方法，其特征在于，与control组相比HM组骨骼肌GLUT4 m RNA的表达量，显著下调，P＜0.05，说明高血脂症小鼠机体对糖利用率降低了；与HM组相比CA组和血脂康组，骨骼肌GLUT4 m RNA的表达量明显上调，P＜0.05，说明CA提高了小鼠机体对糖的利用率；CA组与control组相比无明显差异，说明糖的利用恢复到了正常水平。