[发明专利]一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法

摘要

本发明公开一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，首先通过对红曲米进行分离纯化得到红曲霉菌落，并将制得的红曲霉菌落添加到由琼脂、土豆汁、麦芽汁、乳酸、无水乙醇、硝酸钠和磷酸二氢钾制得的培养基中，制得红曲霉孢子，然后通过氯化钠无菌水对培养基进行冲洗，得到红曲霉孢子菌悬液，将红曲霉孢子菌悬液通过紫外线照射进行物理诱变后，再添加硫酸二乙酯溶液进一步诱变，最后将得到的红曲霉孢子菌悬液与大米粉混合，使得红曲菌株快速繁殖；本申请通过原子能辐射诱变的方法结合高温打堆的培育方法，有效提高了培养基中红曲菌株的繁殖速率，红曲菌株增多，代谢的莫纳克林K也递增，进而提高莫纳克林K的产量。 1

主权项

1.一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)红曲霉菌种的制备，包括以下具体步骤：A、分离纯化，先将红曲米与蒸馏水按比例3∶1混合，并经过研磨机制得米浆，然后通过过滤器过滤得到菌悬液，备用；B、取具体步骤A中制得的菌悬液滴到由大豆汁制得的红曲增殖培养基中，于30℃的恒温箱内培养5‑7天，再按10％的接种量进行第二次增殖培养5‑7天，选取纯化后的红曲霉菌株，若不纯即可再次按10％的接种量进行第三次增殖培养5‑7天，依次类推，直至分离得到纯化的红曲霉菌株，备用。

2)红曲霉菌落的斜面培养，其具体步骤为：A、培养基的制备，取琼脂13g、土豆汁450mL、麦芽汁450mL、乳酸7mL、无水乙醇100mL、硝酸钠200mL和磷酸二氢钾200mL添加到培养皿中，并与蒸馏水按2∶1混合，通过搅拌棒搅拌均匀，同时在搅拌的过程中，添加氯化钙用于将培养基的PH值调整至4.0，然后将制得的培养基置于杀菌锅内，在121℃的高温以及0.1MPa下灭菌20‑25min，然后密封取出，置于30℃的恒温箱内发酵培养8‑10天，制得用于接种的培养基，备用；B、红曲霉菌落接种，取步骤1)制得红曲霉菌落中的菌丝接入具体步骤A制得的培养基内，使得红曲霉菌丝在培养基内生长出红曲霉孢子，备用；

3)红曲霉诱变出发菌株及筛选，其具体步骤为：A、取20mL0.8％氯化钠无菌水从步骤2)中的培养基表面进行冲洗，使得红曲霉孢子脱离培养基，制得红曲霉孢子菌悬液，备用；B、原子能辐射诱变，将具体步骤A制得的红曲霉孢子菌悬液置于⁶⁰Co‑Y射线下方40CM处进行辐射诱变，采用15万拉德诱变剂量的⁶⁰Co，并且持续辐射诱变30min，制得诱变红曲霉孢子菌悬液，备用；

4)将步骤3)经过辐射诱变后的红曲霉孢子菌悬液均匀洒在摊凉的大米粉上，通过手工翻拌2‑3遍，保证红曲霉孢子菌悬液均匀分别在大米粉上，然后将接种均匀的大米粉堆在纱网下，并加铺毛毯，备用；

5)将步骤4)制得含有红曲霉孢子菌悬液的大米粉在高温房打堆，当室温低于20℃时，在高温房打堆；当室温高于20℃时，在曲池打堆，并在打堆过程中，其堆厚35‑40cm，表面覆以灭菌的毛毡保温，保持室温20‑30℃，持续15‑20小时，备用；

6)将步骤5)打堆完成的含有红曲霉孢子菌悬液的大米粉进行摊堆，并在表面上喷施蒸馏水，使得大米粉保持约35％‑55％的水分，并在室温20‑25℃的温度培养4天，收集后送入烘干机内进行烘干，备用；

7)莫纳克林K的提取：取步骤6)制得的大米粉碾碎，并采用75％乙醇回流提取3次，每次3小时，然后合并提取液并除去红曲色素，最后将提取液进行浓缩，并通过测定吸光度计算莫纳克林的含量，即得。

2.如权利要求1所述的一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，其特征在于：所述步骤2)中乙醇的浓度为95％。

3.如权利要求2所述的一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，其特征在于：所述步骤6)中的大米粉为红曲米面团。