[发明专利]应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切优化方法

摘要

本发明涉及应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切优化方法，包括提取细胞核、酶切反应、回收DNA片段、数据预处理和可靠性检验。首先，对组织的细胞核的前期收集方法进行改进，并通过细胞核的数量，优化酶切反应条件，提高了DNase I的酶切效率。其次，采用DNase I的酶切方法与高通量方法的结合，不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够降低由于前期研磨样本产生的假阳性，能够在精准定位转录调控元件在全基因组上的结合位点，提高了临床样本的研究进程。最后，还对高通测序数据的可靠性进行检验。

主权项

1.应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切优化方法，其特征在于，该方法包括以下处理步骤：步骤一：提取细胞核：首先，将收集的组织样本在冰浴中研磨成粉状；然后，加入细胞核提取液并在冰上静置10分钟，所述细胞核提取液包括：10mM MgSO4，5mM KCl，0.5mM HEPES，1mg/L DDT，0.25wt％Triton-100，2wt％PVP40；再在冰上分别以孔径为100、50和20μm的尼龙膜过滤静置后的液体；而后，将过滤后的液体在4℃下离心10分钟，除去上层清液得到悬浮物；最后，将所述悬浮物加入到细胞核贮存液中，所述细胞核贮存液包括：10mM MgSO4，5mM KCl，0.5mM HEPES，1mg/L DDT；步骤二：酶切反应：首先，在步骤一得到的液体中加入脱氧核糖核酸酶I，在37℃下孵育10分钟；然后，加入与所述脱氧核糖核酸酶I等量的EDTA终止所述酶切反应；步骤三：回收DNA片段：首先，将步骤二得到的液体加入到融化好的琼脂糖中，在55℃下孵育15分钟，所述琼脂糖的质量分数为1％；然后，进行脉冲场电泳，条件为12小时，20～50秒切换，5v/cm，1wt％琼脂糖；再将电泳后的产物用T4DNA聚合酶缓冲液洗涤后，加入Tris缓冲液，在65℃下孵育10分钟，融化凝胶；最后，回收融化凝胶中的DNA；步骤四：数据预处理：首先，将步骤三回收的DNA进行高通量测序得到DNase-seq数据；然后，将所述DNase-seq数据进行接头过滤后进行读段定位，将得到的读段回填到参考基因组上得到读段回填结果；步骤五：可靠性检验：首先，将所述DNase-seq数据中的基因组序列从第一个碱基对开始依次划分为多个长度为100bp的非重叠的连续的检验片段，并按照划分的次序对所述检验片段编号，检验片段的编号为由1开始的连续的正整数序列；其次，统计每个检验片段内的读段数量；然后，用公式一计算可靠因子：公式一：其中，γ是所述可靠因子，为0～1之间的实数；i是所述检验片段的编号，为正整数；n是检验片段的个数，为正整数；x是所述检验片段内的读段数量，xi是编号为i的检验片段内的读段数量，xi-1是编号为i-1的检验片段内的读段数量，所述x、所述xi-1和所述xi为正整数；最后，所述可靠因子的处理方法为：如果所述可靠因子大于0.7，则酶切效率达到要求，所述DNase-seq数据可靠；否则，所述酶切效率达不到要求，所述DNase-seq数据不可靠。