[发明专利]雄蚕蛾外泌体的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种雄蚕蛾外泌体的制备方法及其应用，属于生物技术领域。本发明采用健康雄蚕蛾活体制成匀浆，差速离心分离、低温超速纯化获得高纯度的外泌体，动物皮肤损伤实验疗效良好，且外泌体可以制成冻干粉，长期保存，与不同辅料配合形成不同的制剂产品，具有极佳的市场前景和临床价值。

主权项

一种雄蚕蛾外泌体的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：（1）取健康雄蚕蛾活体用生理盐水或PBS浸泡，组织匀浆机打碎制成匀浆，匀浆后离心30min，收集上清液，沉淀部分另作他用，所述离心力为3000g；(2)将步骤（1）的上清液离心100min，收集上清液，沉淀部分另作他用，所述离心力为10000g；(3)将步骤（2）的上清液离心100min，弃上清液，收集沉淀，所述离心力为100000g；(4)将步骤（3）的沉淀加入PBS重混后，离心120min，弃上清液，收集沉淀，沉淀用PBS混悬，所述离心力为120000g；（5）在步骤（4）的PBS混悬液中加入甘露醇至终浓度为10%，混匀后滤膜过滤；（6）将步骤（5）的过滤液分装后置于冷冻干燥机冷冻仓，以1‑2℃/min速度降温至‑40℃，‑40℃维持2h；然后开启真空，干燥机真空度维持在160‑200μbar，冷凝器温度控制在‑50℃‑‑60℃，搁板温度由‑40℃逐步上升至6℃，时间为20‑24h，随后进入解析干燥阶段，搁板温度由6℃上升至35℃，真空度维持在220‑250μbar，时间为4‑6h，当制品温度与搁板温度相差1‑2℃范围内时，在关闭大蝶阀60s内干燥箱内压力无明显上升，冻干过程结束，得到雄蚕蛾外泌体冻干粉。