[发明专利]头花蓼不同极性部位抑菌作用的谱效学分析方法

摘要

本发明涉及头花蓼不同极性部位抑菌作用的谱效学分析方法。具体的，包括以下步骤：材料提供，药物提取与分离，UPLC分析与质谱分析，最低抑菌浓度的测定，头花蓼不同极性部位各峰与1/MIC之间的偏最小二乘回归分析。本发明通过UPLC‑TOF‑MS质谱联用技术能够全面的分析确定头花蓼不同极性部位的化学成分并结合药效试验，采用PLSR法分析筛选、确定头花蓼中的抑菌物质，从分子化学水平阐明头花蓼在治疗大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌尿路感染药效物质基础。

主权项

头花蓼不同极性部位抑菌作用的谱效学分析的方法，其包括以下步骤：(1)材料提供：提供超高效液相色谱系统和液相色谱‑质谱联用仪，提供头花蓼药材，提供抑菌检测用菌株；(2)药物提取与分离：(21)取头花蓼药材加6～8倍量60～80％乙醇提取2次，每次1～2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩成稠膏，减压干燥、粉碎成细粉，即得头花蓼醇提浸膏；(22)另取头花蓼醇提浸膏样品，加甲醇适量，超声提取3次，滤液合并，离心，取上清液减压蒸馏除去溶剂，用20～40％甲醇溶解后，载入MCI型大孔树脂柱，进行层析分离；(23)分别用体积分数为30％、35％～40％、40％、40％～50％、50％、60％、60％～80％的甲醇进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，并挥干，得到A～G共七个不同极性的部位；(24)精确称取A～G七个部位，分别溶于DMSO中，配成质量浓度为25mg/mL的溶液，备用；(3)UPLC分析与质谱分析：(31)色谱及质谱条件：色谱条件：C18色谱柱，柱温40℃，流速0.35L/min，进样量2μL，流动相使用0.1％甲酸水溶液(A)‑0.1％甲酸乙腈溶液(B)进行梯度洗脱；质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，干燥气体温度180℃，毛细管电压4 500eV，负离子检测模式，喷雾压力0.25MPa，干燥气(N2)流速8L/min，扫描范围m/z 100～2 000，碰撞能量10eV；(32)不同极性部位指纹图谱建立：按“(31)色谱及质谱条件”项下条件建立不同极性部位的UHPLC‑TOF‑MS色谱图，并通过质谱确定不同极性部位各峰对应的化合物，从而确定各个部位中的主要化学组成；(4)最低抑菌浓度的测定：(41)按最低抑菌浓度测定方法，进行菌悬液的配制和实验用琼脂平板培养基的制备；(42)按最低抑菌浓度测定方法，测定步骤(24)所得不同极性部位的最低抑菌浓度；(5)头花蓼不同极性部位各峰与1/MIC之间的偏最小二乘回归分析：对于每一个部位，使用SPSS16.0软件的偏最小二乘回归分析法(PLSR)通过其均值化进行分析，以其各物质峰的峰面积作为自变量，1/MIC作为因变量，分析得到各物质峰与药效指标之间的关系，确定与试验菌株成正相关的物质峰以及这些物质所存在的部位。