[发明专利]一种源于光敏色素的黄色荧光标记物的制备方法

摘要

本发明公开了一种源于光敏色素的黄色荧光标记物的制备方法，融合蛋白包括蓝细菌光敏色素蛋白slr1393的第3个GAF结构域和链霉亲和素。本发明的融合蛋白序列，易于在微生物中稳定表达，规避了高纯度天然藻胆蛋白和蓝细菌光敏色素的获取困难，制备成本较高；化学修饰剂的使用；天然藻胆蛋白聚合形态不稳定等缺点。本发明的表达方法，无需藻胆蛋白裂合酶参与，减少转化的基因数量，提高菌种稳定性和筛选效率。同时通过优化发酵培养基和发酵条件，大大提高了融合蛋白的产量。 1

主权项

1.一种融合蛋白，其包括蓝细菌光敏色素蛋白slr1393的第3个GAF结构域和链霉亲和素。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：融合蛋白中还添加有亲和标记。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：融合蛋白的序列为：

MGSSHHHHHHSQDPEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASGSGTDDDDKAMADGLQNIFRATSDEVRHLLSCDRVLVYRFNPDWSGEFIHESVAQMWEPLKDLQNNFPLWQDTYLQENEGGRYRNHESLAVGDVETAGFTDCHLDNLRRFEIRAFLTVPVFVGEQLWGLLGAYQNGAPRHWQAREIHLLHQIANQLGVAVYQAQLLARFQE。

4.表达权利要求1或2所述融合蛋白的核苷酸序列。

5.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于：核苷酸序列根据宿主菌进行密码子优化。

6.插入有权利要求3或4所述核苷酸序列的质粒。

7.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于：质粒为pET Duet载体质粒，核苷酸序列通过酶切位点BamHⅠ、EcoRⅠ插入pET Duet载体质粒的多克隆位点1。

8.一种融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)根据权利要求1或2所述融合蛋白的序列，设计得到融合蛋白基因序列；

2)将融合蛋白基因序列插入到质粒中，得到融合蛋白质粒；

3)将融合蛋白质粒和表达藻红胆素合成的相关基因：血红素氧化酶基因ho1，胆绿素还原酶基因pebS的质粒共转入大肠杆菌，得到基因工程菌；

4)使用三级接种方法在培养基中接种基因工程菌，37℃发酵培养至生长前期；

5)降温至20℃，培养0.8～1.2h；

6)升温至25℃，加入终质量浓度为1.3～1.6％的乳糖诱导培养14～16h；

7)收集菌体提取、纯化得到融合蛋白。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：发酵培养基的质量组成为：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，甘油0.4％，0.004％～0.04％猪血球蛋白粉或血红素，余量为水，pH值调至7.2。

10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于：加入终质量浓度为1.5％的乳糖诱导培养。