[发明专利]一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法

摘要

本发明涉及一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法，其包括如下步骤：取足月脐带，鉴定符合要求后方可用；将脐带剪成组织段，剥离华通胶，将华通胶剪成块状；采用双酶法消化脐带组织块；过滤收集细胞，使用含有脐血血浆的培养基培养与扩增间充质干细胞；采用饥饿培养法，制备上清液；在上清液中加入保护剂进行保藏。本发明提供的脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法确保在4℃存放15天后，干细胞上清中的蛋白含量无明显变化，延长干细胞培养上清液在4℃的存放时间，降低干细胞培养上清的运输成本。

主权项

1.一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)取足月健康胎儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA，抗-HDV，抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA，CMV-DNA，检测结果均为阴性的脐带方可使用；(2)将脐带剪开，平铺，用PBS缓冲液清洗脐带组织至无血色；(3)将步骤(2)获得的脐带组织剪成组织段，然后剥离所述组织段的华通胶，并将华通胶置于洁净的器皿中，用手术剪剪成块状；(4)在步骤(3)获得的块状组织中，先后加入0.1％II型胶原酶和0.25％胰酶进行消化，使用筛网过滤收集细胞溶液，然后离心，去掉上清液；(5)使用含有脐血血浆的培养基重悬步骤(4)获得的细胞沉淀，放入纤维连结蛋白包被的培养瓶中，加入足量的含有脐血血浆的培养基，置于CO2培养箱内培养；(6)在培养后的4～5天进行第一次换液，以后3～4天换一次液，待细胞融合度达到70％以上后，使用胰蛋白酶进行消化后传代；(7)按6000cells/cm2的密度接种P5代脐带间充质干细胞细胞于培养瓶中，加入含有脐血血浆的培养基进行培养；(8)待细胞长至80％融合时，使用PBS缓冲液冲洗细胞表面多次，然后加入DMEM/F12培养基进行饥饿培养；(9)收集步骤(8)获得的脐带间充质干细胞培养上清液至离心管中，离心，弃沉淀；(10)收集步骤(9)获得的上清液，使用5KD的透析袋对干细胞上清进行浓缩，获取含有5KD以上分子量的有效干细胞分泌混合因子；(11)在步骤(10)获得的浓缩上清液中加入上清液保护剂，充分混匀后置于4℃保藏。