[发明专利]应用于组织样本中染色体开放结合区域定位的ATAC-seq方法

摘要

本发明涉及应用于组织样本中染色体开放结合区域定位的ATAC‑seq方法，包括细胞悬液制备、转座反应与纯化、去除杂质、PCR扩增、高通量测序、概率检测。该方法采用转座酶法进行DNA片段化，将繁琐的DNA片段化、末端修复和接头连接反应等步骤变为一步简单的酶促反应，缩短实验时间。可以快速的得到调控的多维信息，比其他方法要节省大约3到5个数量级的细胞。实验流程中没有片段选择的步骤，所以这种方法可以同时获得“开放”染色质的位置、转录因子的结合位点、核小体的调控区域和染色质状态等信息。

主权项

1.应用于组织样本中染色体开放结合区域定位的ATAC-seq方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：细胞悬液制备：制备含有2×106～5×106个细胞的细胞沉淀，将所述细胞沉淀在4℃下匀浆500g中离心10min后得到混合物M，将所述混合物M用预冷的PBS缓冲液洗涤后得到混合物A；所述PBS缓冲液包括：200mM NaCl，3mM KCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.1wt％吐温－20，所述PBS缓冲液的PH值为7.4；步骤二：转座反应与纯化：在所述混合物A中加入25ul TE缓冲液、2.5ul Tn5转座酶和22.5ul DEPC处理水，在37℃水浴中反应30min得到混合物B；所述TE缓冲液包括：10mM Tris-HCl，PH＝8.0，1mM EDTA，PH＝8.0；在所述混合物B中加入2.5ul溴化乙锭溶液，轻轻摇匀15min后，再在4℃下匀浆500g中离心15min得到混合物C；在所述混合物C中加入与所述混合物C等体积的氯仿醇溶液，温和混匀后静置10min，取上层清液得到混合物D；所述氯仿醇溶液包括：Tris饱和酚、氯仿、异戊醇，体积比为25:24:1；在所述混合物D中加入无水乙醇后静置沉淀，得到纯化DNA；所述混合物D和所述无水乙醇的体积比为1:2；步骤三：去除杂质：在所述纯化DNA中加入Washing buffer，轻度漂洗1～5min后倒出漂洗后的Washingbuffer，得到混合物E；在所述混合物E中加入Blocking Solution，静置0.5h后倒出静置后的BlockingSolution，得到混合物F；在所述混合物F中加入Antibody Solution，静置0.5～1h后倒出静置后的AntibodySolution，得到混合物G；在所述混合物G中加入所述Washing buffer，漂洗15min后倒出漂洗后的Washingbuffer，得到纯净DNA；步骤四：PCR扩增：以所述纯净DNA为模板进行预扩增，所述预扩增的反应体系共25ul，包括2ul所述纯净DNA，2ul引物A，0.2ul Taq DNA聚合酶,1ul dNTPs，2.5ul 10×PCR buffer，17.3ul H2O；混匀所述预扩增的反应体系,按照下列步骤进行预扩增：首先，94℃变性2min；然后，按照以下参数扩增30个循环：94℃30sec，56℃30sec，72℃80sec；最后，72℃延伸5min；以预扩增的产物为模板进行选择性扩增，所述选择性扩增的反应体系共15ul，包括2ul所述预扩增的产物，1.2ul引物B，0.12ul Taq DNA聚合酶,0.6ul dNTPs，1.5ul 10×PCR，9.58ul H2O；混匀所述选择性扩增的反应体系,按照下列步骤进行选择性扩增：首先，按照下列参数进行第一轮扩增：94℃2min，94℃30sec，56℃30sec，72℃80sec；然后，按照每轮的循环温度递减1℃，扩增10轮；最后，再以94℃2min，55℃30sec，72℃80sec扩增30轮后得到扩增产物；步骤五：高通量测序：首先将所述扩增产物进行高通量测序得到ATAC-seq数据；然后将所述ATAC-seq数据进行接头过滤后再进行读段定位，将得到的读段回填到参考基因组上得到读段回填结果；步骤六：概率检测：首先，读取所述ATAC-seq数据，并将其比对到所述参考基因组上，寻找出开放染色质位点富集的特征峰和峰顶点的位置信息；以所述峰顶点为中心分别向左右两侧延展100bp，延伸后的数据中，每一个DNA序列的中心均为所述峰顶点；将所述DNA序列提取出来并去掉其中重复的序列得到DNA短序列，并按照提取的次序对所述DNA短序列进行编号，DNA短序列的编号是由1开始的连续的正整数序列；然后，统计每个DNA短序列内的读段数量和每个DNA短序列内的碱基数量；其次，计算DNA短序列的开放概率，用公式一计算：公式一：其中，n是DNA短序列的个数，为正整数；i是所述DNA短序列的编号，为正整数；δ是所述DNA短序列的开放概率，δi是编号为i的DNA短序列的开放概率，所述δ和所述δi为0～1之间的实数，没有单位；x是所述DNA短序列内的读段数量，xi是编号为i的DNA短序列内的读段数量，所述x和所述xi为正整数；y是所述DNA短序列内的碱基数量，yi是编号为i的DNA短序列内的碱基数量，所述y和所述yi为正整数；最后，所述δi的处理方法为：如果所述δi大于0.5，则编号为i的DNA短序列是所述开放染色质位点；如果所述δi不大于0.5，所述编号为i的DNA短序列不是所述开放染色质位点。