[发明专利]一种基于核酸外切酶III辅助目标循环放大的无标记DNA质谱定量分析方法

摘要

本发明公开了一种基于核酸外切酶III辅助目标循环放大的无标记DNA质谱定量分析方法。该方法将核酸外切酶III辅助目标循环放大策略、质谱和波谱形变定量理论模型结合在一起，能够实现复杂生物样本中目标DNA的灵敏且准确的定量分析。同时，该方法克服了现有用于鉴别单核苷酸多态性方法的不足，利用质谱具有识别不同的残余DNA片段的能力，本发明提出的策略能够明确鉴别单核苷酸多态性。

主权项

1.一种基于核酸外切酶III辅助目标循环放大的无标记DNA质谱定量分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据目标DNA的碱基序列，设计能够与目标DNA碱基序列杂交形成双链的探针DNA，所述探针DNA的3′端为平末端，所述目标DNA的3′端为具有至少4个碱基以上的突出端；(2)往目标DNA与探针DNA的杂交反应液中加入核酸外切酶III(Exo III)，Exo III能识别由目标DNA和探针DNA杂交所形成的双链DNA的3′平末端，并沿3′端到5′端的方向酶切水解探针DNA产生单个核苷酸和残余的DNA片段，同时释放出目标DNA，释放出来的目标DNA又与第二条探针DNA杂交从而引发下一个Exo III水解探针DNA的循环反应；经过多次循环放大后通过加热使Exo III失活从而停止反应，得反应混合物；(3)将反应混合物通过透析纯化除去高浓度的盐离子以达到质谱检测的要求，然后使用质谱仪检测探针DNA的残余片段和未水解的探针DNA，并将带多电荷数的残余DNA序列和未水解的探针DNA序列的质谱响应构建成一条质谱数据矢量；(4)根据步骤(3)的结果，使用波谱形变定量分析理论在空白样本和标准样本的质谱数据基础上建立校正模型，并将校正模型用于复杂生物样本中目标DNA的定量分析及DNA单核苷酸多态性的特异性识别；所述空白样本是未添加探针DNA的待测实际样本，所述标准样本为目标DNA配制成的样本。