[发明专利]一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法

摘要

本发明涉及一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法。具体技术方案如下：将多肽链CBD固定在色谱柱填料上成为CBD色谱柱，多肽链CBD是能与钙调蛋白特异性结合的多肽；将目的蛋白以LIC克隆方法克隆到带有钙调蛋白标签的HCT表达载体中，转化表达蛋白，采用超生破碎法破菌取上清，获得可溶蛋白溶液；将所得蛋白溶液用CBD色谱柱纯化；然后用疏水色谱柱进一步纯化，继而用TEV酶进行酶切；最后用Talon柱除去标签和TEV酶。该方法利用同一标签进行多步亲和层析，非常快速高效。

主权项

1.一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，其特征在于，过程如下：

步骤一：将多肽链CBD固定在色谱柱填料上成为CBD色谱柱；多肽链CBD是能与钙调蛋白特异性结合的多肽；

步骤二：将目的蛋白以LIC克隆方法克隆到HCT表达载体中，转化表达蛋白，采用超生破碎法破菌取上清，获得可溶蛋白溶液；

步骤三：将所得蛋白溶液用CBD色谱柱纯化；

步骤四：然后用疏水色谱柱进一步纯化，继而用TEV酶进行酶切；

步骤五：最后用Talon柱除去标签和TEV酶。

2.根据权利要求1所述一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，其特征在于，该多肽链CBD为家兔鱼尼丁受体中能与钙调蛋白特异性结合的区域。

所述CBD柱Buffer B包括：10mM HEPES pH7.4，250mM KCl，5mM EDTA；

所述CBD柱Buffer C包括：10mM HEPES pH7.4，250mM KCl。

3.根据权利要求2所述一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，其特征在于，所述步骤二包括如下过程：

将HCT‑GFP质粒转化到BL21(DE3)细胞中，2YT培养基(含50μg/mL卡那霉素)37℃培养到OD到达约0.6，0.4mM IPTG 30℃诱导培养6小时；

离心收集250ml表达蛋白的细菌培养物，8000g离心10min；

加入40ml Lysis buffer重悬，冰浴下超声破碎；

40，000g离心30分钟，弃沉淀，取上清；

所述Lysis buffer包括：10mM HEPES pH 7.4,250mM KCl，25mg/ml DNA酶,25mg/ml溶菌酶,1mM PMSF，5mM CaCl₂。

4.根据权利要求2所述一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，其特征在于，所述步骤三包括如下过程：

预先将多肽链CBD固定在色谱柱上,用5倍柱体积CBD柱Buffer A进行平衡；

以1‑2ml/min的流速上样于预先平衡好的CBD色谱柱；

然后用2倍柱体积CBD柱Buffer C将色谱柱上的残留样品洗去；

用5倍柱体积CBD柱Buffer B洗脱，收集洗脱样品；

所得样品用2L透析BufferA进行4h透析，除去所含EDTA，透析过后加入10mM CaCl₂；

所述CBD柱Buffer A包括：10mM HEPES pH7.4，250mM KCl，5mM CaCl2；所述CBD柱Buffer B包括：10mM HEPES pH7.4，75mM KCl,10mM EDTA；所述CBD柱Buffer C包括：10mM HEPES pH7.4，150mM KCl。

5.根据权利要求2所述一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，其特征在于，所述步骤四包括如下过程：

用5倍柱体积疏水柱Buffer A平衡疏水色谱柱；

以1‑2ml/min的流速上样于预先平衡好的色谱柱；

用2倍柱体积疏水柱Buffer C将色谱柱上的残留样品洗去；

用5倍柱体积疏水柱Buffer B洗脱，收集洗脱样品；

所得样品用2L透析BufferB进行透析(除去所含EDTA)并用TEV酶进行酶切；

所述疏水柱Buffer A包括：10mM HEPES pH7.4，150mM KCl，10mM CaCl2；

所述疏水柱Buffer B包括：10mM HEPES pH7.4，75mM KCl,10mM EDTA；

所述疏水柱Buffer C包括：10mM HEPES pH7.4，150mM KCl。

6.根据权利要求2所述一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，其特征在于，所述步骤五包括如下过程：

用5倍柱体积Talon柱Buffer A平衡色谱柱；

以1‑2ml/min的流速上样于预先平衡好的色谱柱；

用5倍柱体积Talon柱Buffer B洗脱，收集未与色谱柱结合的样品；

所述Talon柱Buffer A包括：10mM HEPES pH7.4，250mM KCl；

所述Talon柱Buffer B包括：10mM HEPES pH7.4，250mM KCl，150mM咪唑。