[发明专利]以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法

摘要

以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，本发明属于生物技术领域，它为了解决水体环境病毒宏基因组研究中病毒浓缩液中存在少量的寄主细胞，影响测序结果的问题。水体环境病毒宏基因组解析的方法：一、水样经纱布过滤，通过过滤系统的滤柱去除细菌，浓缩后离心处理，配置病毒颗粒超离浓缩液；二、向浓缩液中加入DNase和RNase工作液，进行PCR扩增，检测是否消化彻底，如没有消化彻底，则加入溶菌酶裂解细菌细胞，继续消化，高温灭活核酸酶，得到不含寄主遗传物质污染的病毒颗粒浓缩液：三、扩增病毒全基因组。本发明通过溶菌酶处理样品，将污染细菌细胞DNA释放出来，然后被核酸酶消解掉操作简便、适用性强。

主权项

1.以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，其特征在于该方法按以下步骤实现：一、水体病毒颗粒分离浓缩：a、采集野外水体，得到水样；b、水样经多层尼龙纱布过滤，然后通过切向流过滤系统的滤柱去除细菌，得到病毒颗粒溶液；c、病毒颗粒溶液经切向流过滤系统的滤柱浓缩，得到病毒颗粒浓缩液；d、将病毒颗粒浓缩液加到超速离心管中，在超速离心管底部加入质量浓度为19％～21％的蔗糖溶液，然后进行离心处理，得到离心后的病毒颗粒浓缩液；e、倒出超速离心管内液体后倒置在滤纸上静置，再用灭菌超纯水重悬附着在超速离心管底部管壁的病毒颗粒，得到病毒颗粒超离浓缩液；二、病毒浓缩液寄主遗传物质消除：f、向步骤e的病毒颗粒超离浓缩液中加入DNase和RNase工作液，在36～38℃条件下水浴处理，得到酶解的病毒颗粒浓缩液；g、从步骤f酶解的病毒颗粒浓缩液中取出1～2μL，采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，用于检测是否有寄主遗传物质污染；当凝胶电泳检测没有目标条带，则表明消除寄主遗传物质污染，然后将无寄主DNA污染病毒浓缩液在78～82℃金属浴上处理，灭活浓缩液中的DNase和RNase酶活性，得到不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液；当凝胶电泳检测有目标PCR条带，则表明存在寄主遗传物质污染，向步骤f酶解的病毒颗粒浓缩液加入溶菌酶，在36～38℃条件下水浴2.5～3.5h，然后取出1～2μL采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，凝胶电泳检测没有目标条带，表明消除寄主遗传物质污染，然后无寄主DNA污染病毒浓缩液在78～82℃金属浴上处理，灭活浓缩液中的DNase和RNase酶活性，得到不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液；三、病毒宏基因组提取及全基因组扩增：h、采用试剂盒提取不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液的病毒基因组，再对获得的病毒基因组进行多重置换全基因组扩增，所得MDA病毒宏基因组样品经沉淀纯化后，进行病毒宏基因组测序分析。