[发明专利]鉴别刺山柑和薄叶山柑的方法及其应用

摘要

本发明公开了鉴别刺山柑和薄叶山柑的方法及其应用，包括使用PCR扩增叶绿体DNA的psbA‑trnH核苷酸序列，以及构建psbA‑trnH核苷酸序列的系统发育树，本发明所涉及的鉴别刺山柑和薄叶山柑的方法可快速、准确地鉴别出刺山柑和薄叶山柑，有效解决刺山柑药材的品种鉴定、改良、以及种质资源的开发利用等问题；本发明方法适用性广，操作简单，易于掌握，准确性高，能够成功实现对刺山柑和薄叶山柑两者药材及粉末的快速、准确鉴别。 1

主权项

1.一种鉴别刺山柑和薄叶山柑的方法，其特征在于，包括使用PCR扩增叶绿体DNA的psbA‑trnH核苷酸序列，以及构建psbA‑trnH核苷酸序列的系统发育树。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提取样品总DNA；

(2)以总DNA为模板，PCR扩增psbA‑trnH核苷酸序列；

(3)对扩增产物进行测序、拼接，获得psbA‑trnH基因间隔区核苷酸序列；以及

(4)构建样品的psbA‑trnH核苷酸序列的系统发育树。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品为刺山柑和薄叶山柑。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，PCR扩增的特异性引物为：

F：5’‑GTTATGCATGAACGTAATGCTC‑3’(即SEQ ID NO.1)；

R：5’‑CGCGCATGGTGGATTCACAATCC‑3’(即SEQ ID NO.2)。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增的体系为：

2.5mmol/L的10×PCR Buffer 2‑3μL，2.5mmol/L的dNTPs 1.5‑2.5μL，10μmol/L的PCR扩增的特异性引物各0.3‑0.7μL，DNA模板2‑4μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2‑0.3μL，补ddH₂O至25μL。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增的体系为：

2.5mmol/L的10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/L的dNTPs 2μL，10μmol/L的PCR扩增的特异性引物各0.5μL，DNA模板3μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.25μL，补ddH₂O至25μL。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，PCR扩增的条件为：94℃预变性3‑7min；94℃0.5‑1.5min，55℃0.5‑1.5min，72℃1‑2min，共29‑32个循环；72℃延伸5‑9min；最终置于12℃。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，共30个循环；72℃延伸7min；最终置于12℃。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，使用序列对比软件，构建待测样品的psbA‑trnH序列的系统发育树，通过系统发育树鉴别出刺山柑与薄叶山柑。

10.权利要求1‑9任一项所述的方法在鉴别刺山柑与薄叶山柑的基原植物、果实、根皮、茎中的用途。