[发明专利]一种胃癌新型分子标记物tRF-5026a的检测及应用

摘要

本发明涉及一种用于胃癌诊断的tRF分子标志物，其特征在于：该tRF为tRF‑5026a，本发明还提供一种检测胃癌tRF分子标志物的方法，包括如下步骤:(1)收集胃癌组织；(2)获得浓度纯度较高的RNA；(3)前处理并逆转录成cDNA；(4)进行荧光染料法qRT‑PCR检测；(5)tRF和外参基因采用特异性上下游扩增引物；(6)通过统计出胃癌组织中目的tRF和外参基因的Cq值；(7)采用ΔCq＝Cq(targettRF)‑Cq(reference)的计算方法对tRF进行相对定量，与现有技术相比，本发明的优点在于在胃癌组织中的特异性表达下调tRF‑5026a可作为胃癌诊断的新型分子标记物。

主权项

1.一种用于胃癌诊断的tRF分子标记物，其特征在于：该tRF为tRF‑5026a，它在基因组上的定位为：chr6‑26538282‑26538354，对应的tRNA为chr6.trna9‑ValCAC，该tRF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，为GTTTCCGTAGTGTAGTGG。

2.根据权利要求1所述的用于胃癌诊断的tRF分子标记物，其特征在于：所述tRF‑5026a在胃癌患者癌组织中的特异性表达水平下调。

3.一种检测胃癌组织中如权利要求1所述的tRF分子标记物的方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤：

(1)采集胃癌组织，称取组织，提取组织中的总RNA；

(2)将总RNA前处理并逆转录成cDNA；

(3)将cDNA进行荧光染料法qRT‑PCR检测，反应结束后检测样品中tRF‑5026a和外参基因RNU6‑2的Cq值；

(4)根据Cq值，通过外参基因RNU6‑2的表达水平来均一化tRF的水平，计算得到tRF‑5026a的相对表达水平，并使用2^‑ΔΔCq公式来计算tRF‑5026a的PCR相对定量值，式中ΔCq＝Cq_{(tRF‑5026a)}‑Cq_(RNU6‑2)；

(5)当样本中的tRF‑5026a生物标志物的PCR相对定量值ΔCq小于或等于14.03时，则认为是非胃癌样本；大于14.03时，则认为是胃癌样本。

4.根据权利要求3所述的检测tRF分子标记物的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的tRF‑5026a的特异性扩增上下游引物为：

F1：5’‑TCGGCCGACGATCGTTTCC‑3’；

R1：5’‑CCGCGTCCGATCTCCACTA‑3’。

5.根据权利要求3所述的检测tRF分子标记物的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的外参基因RNU6‑2的特异性扩增上下游引物为：

F2：5’‑GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT‑3’；

R2：5’‑CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT‑3’。

6.根据权利要求3所述的检测tRF分子标记物的方法，其特征在于：所述步骤(1)中提取胃癌组织中总RNA的过程如下：

步骤a、收集胃癌组织样本：取10～20mg的胃癌组织，浸泡在1～2mL的RNA保存液的无核酸酶离心管中；

步骤b、裂解组织：在步骤a中的离心管中加入1～2mL的总RNA提取试剂TRIzol，将胃癌组织充分研磨匀浆成匀浆液，室温静置5～8分钟，使组织中的RNA充分释放至匀浆液中；

步骤c、三氯甲烷提取：加入200～300μL三氯甲烷，通过涡旋震荡，室温静置3分钟；12000rpm，4℃离心15分钟，此时液体会分层，其中RNA在上层水相中富集，小心吸取上层水相约0.5mL～1.5mL至无核酸酶离心管中；

步骤d、异丙醇沉淀：加入与步骤c中上层水相等体积的异丙醇，摇晃混匀，在冰上静置10分钟后12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清得RNA沉淀；

步骤e、乙醇洗涤并沉淀：倾倒上清并加入质量分数为75％的乙醇1mL清洗沉淀，4℃下，12000rpm离心3分钟，弃上清，晾干后加入适量无核酸酶RNase水来溶解沉淀，即为组织中的总RNA提取液，于‑80℃保存备用。

7.根据权利要求3所述的检测胃组织中tRF分子标记物的方法，其特征在于，所述步骤(3)中荧光定量PCR反应条件如下：先95℃预变性5分钟；然后95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，50个循环；最后95℃变性1分钟，55℃退火30秒，95℃酶变性30秒，4℃保温。

8.一种根据权利要求1所述的tRF分子标记物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。