[发明专利]一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1.FHM细胞复苏提纯；S2.FHM细胞基础培养；S3.FHM细胞扩大培养；S4.IHNV病毒培养；S5.IHNV病毒提纯；S6.IHNV病毒灭活。该方法制备得到IHNV灭活疫苗应用于预防传染性造血器官坏死病；通过该方法可成功制得IHNV灭活疫苗，灭活效果好，灭活疫苗安全性高，相对免疫保护率高，同时该制备方法工艺简单，有利于缩减疫苗大规模生产的周期和成本，可用于工业制备IHNV灭活疫苗用于预防传染性造血器官坏死病。

主权项

一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1. FHM细胞复苏：将冻存的FHM细胞置于35℃‑38℃下恒温水浴1‑3min，然后再800‑1000 r/min 离心4‑6 min，去掉上清液，得到复苏的FHM细胞；S2. FHM细胞基础培养：往S1步骤所得的FHM细胞中加入培养基，然后转移至培养瓶I中培养； 所述培养基中含有体积分数为8%‑10%的FBS；S3. FHM细胞扩大培养：待S2步骤中细胞长满90%‑100%，去掉培养液，用D‑PBS漂洗2‑3次，然后取浓度为0.20%‑0.30%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，待1‑2分钟后去掉胰蛋白酶；然后在细胞液中加入培养基，混匀之后将细胞液转入培养瓶II中，将培养瓶II置于25℃下培养；所述培养瓶II的生长面积是培养瓶I的3‑4倍；所述培养基中含有体积分数为8%‑10%的FBS；S4. IHNV病毒培养：待S3步骤中FHM细胞在培养瓶II中长满90%‑100%，去掉培养液，用D‑PBS漂洗2‑3次，然后加入IHNV毒液，13℃‑17℃孵育1 h ‑2h；之后加入培养基维持液，13℃‑17℃培养3‑4天，收获IHNV病毒；所述培养基中含有体积分数为2%‑5%的FBS；S5. IHNV病毒提纯：将S4步骤得到的IHNV病毒液置于‑80℃~‑20℃下冻融，然后将病毒液4000~8000r/min离心10~15min，收集上清液得到IHNV活病毒液；S6. IHNV病毒灭活：往S5步骤中得到的IHNV活病毒液中加入β‑丙内酯，直至混合液中β‑丙内酯的浓度为0.08‑0.1%，静置灭活，然后将灭活后的混合液置于36℃‑37.5℃ 恒温水浴2h‑2.5h水解β‑丙内酯，最后将水解后的混合液经配制得到IHNV病毒灭活疫苗；其中，所述S1步骤取用的冻存FHM细胞、S2步骤加入的培养基、S3步骤加入的胰蛋白酶、S3步骤加入的培养基、S4步骤加入的培养基维持液的体积比为（1‑1.5）：（4‑6）：（0.2‑1）：（4‑6）：（11‑13）。