[发明专利]一种高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法

摘要

本发明属于基因检测领域，涉及一种高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法。本发明将人全基因组DNA提取后利用特异性引物扩增线粒体DNA，扩增产物纯化后进行打断反应，回收目的片段后进行修饰和接上测序接头得到DNA文库，测序并分析数据。本发明所述的方法能够快速、全面、同时检测人体整个线粒体DNA基因存在的突变、缺失等信息，具有省时省力，特异性强的特点，其不仅能够及时发现线粒体疾病的存在，而且丰富线粒体疾病的数据库，从而可以为临床诊断提供依据。

主权项

1.一种高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法，该检测方法具体包括如下步骤：1)按照人全基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，利用设计的两对mtDNA特异性引物，以提取的线粒体DNA为模板，进行PCR扩增得到线粒体DNA扩增产物1和线粒体DNA扩增产物2，将线粒体DNA扩增产物1和线粒体DNA扩增产物2混合纯化后进行打断反应，使打断后DNA主带大小集中在插入片段大小，然后回收所需大小的目的片段；2)对打断反应后产物末端进行磷酸化修复，并在加3’端加A碱基即得测序产物；给测序产物加上测序接头后进行琼脂糖凝胶电泳分离纯化，回收目标DNA片段形成DNA文库；3)将DNA文库中目标DNA片段进行PCR扩增，使用Agilent 2100进行DNA片段大小和浓度的检测，浓度和片段大小符合要求后进行测序，得到测序数据并进行数据分析；所述的PCR扩增的反应体系包括：PCR为20μl总体系，具体是2X Phanta Max Buffer 10μl，dNTP mix 1μl，Phanta Max Super‑Fidelity DNA Polymerase 1μl，10uM的mtDNA 1F或mtDNA 2F 2μl，10uM的mtDNA 1R或mtDNA 2R 2μl，ddH2O 3μl，10‑100ng的DNA模板1μl；其中mtDNA 1F序列为:TCCCCACATCAAGCCCGAATGATATTTC；mtDNA 1R序列为ATTCCGGATAGGCCGAGAAAGTGTTGT；mtDNA 2F序列为ATTTCACTATCATATTCATCGGCGTAAAT；mtDNA 2R序列为GGGACGGATCGGAGAATTGTGTAGGCGAAT；所述检测是NGS检测，DNA测序通过Illumina HiSeq2000测序。