[发明专利]一种热稳定DNA扩增融合酶

摘要

本发明提供一种热稳定DNA扩增融合酶。该热稳定DNA扩增融合酶由Taq DNA聚合酶与一种来自于海洋纳米古菌（Nanoarchaeum equitans）的DNA结合蛋白相连接获得，所述结合通过Taq DNA聚合酶与DNA结合蛋白通过构建融合蛋白载体进行原核表达实现。表达后的产物保持了Taq DNA聚合酶的聚合活性，同时DNA结合蛋白与PCR反应中的DNA模板‑引物复合体具有较强的结合作用，极大增强了PCR反应的效率。使用该方法制备的DNA扩增融合酶不仅可以广泛使用于分子生物学等科研领域，还可以应用于临床分子诊断、法医学检测、食品及环境监测等多个领域。

主权项

1.一种热稳定DNA扩增融合酶，其特征在于：它采用如下步骤：步骤一：采用全基因合成的重叠PCR延伸方法，利用高保真酶合成SEQ NO.1和SEQ NO.2所显示的核苷酸序列，将两部分所显示的核苷酸序列，通过6个氨基酸GTGTGG所组成的连接序列相连接；步骤二：再将以上所述两部分核苷酸序列和连接序列通过引物重叠PCR连接起来的过程中，对全长片段进行连接时，在上下游引物的两端分别加上EcoRI和SalI两个限制性内切酶的识别和酶切位点，同时在下游引物上加上终止密码；全长扩增后，得到SEQ NO.3所示全长序列，经过双酶切连接到pET28a(+)载体的相应位点，转化大肠杆菌DH5alpha,在500ul的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，提取重组质粒，进行双酶切和测序鉴定，选择含有正确重组质粒的菌落进行保存；步骤三：然后将正确的重组质粒转化到制备的高效感受态大肠杆菌表达菌株BL21中，在500ul的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，保存待用；步骤四：挑选基因工程菌单菌落于含有终浓度为50ug/ml卡那霉素的100ml液体LB培养基中，37℃过夜培养；第二天在5个100ml的培养瓶中加入含有终浓度为50ug/ml卡那霉素的50ml液体LB培养基，将含有过夜培养基因工程菌的菌液按照1:20的比例加入，37℃培养4小时，待OD600达到0.8左右时，其中一个培养管不加IPTG诱导剂，另外四管，两两各加入0.5mM和1mMIPTG，两两各在30℃和37℃诱导培养5小时；5000rpm、10分钟、4℃离心收集和洗涤菌体，重悬于缓冲溶液中，在冰上用超声法破碎细胞，功率100V、间隔5秒、30个循环、循环三次，再4℃、12000rpm离心20分钟，取上清，‑20℃冻存；按照胶厚度0.75cm，浓缩胶5%，80V电泳，10%分离胶，120V电泳，进行SDS‑PAGE电泳；电泳得到的目的片段的大小为108KD左右，与SEQ NO.3所显示的融合酶基因编码的蛋白大小基本一致，融合酶的最佳表达条件为1mM IPTG,37℃诱导培养5小时；步骤五：进行2L级别的发酵培养,诱导和纯化；2L级别的发酵培养和诱导的条件按照步骤四中表达条件确立的方法进行；采用XZ‑8M型人容量低温高速离心机,5000rpm,5分钟,4°C离心去菌液，收集菌体；再重悬于100ml (50mM NaH2P04,500mM KCl,10mM Imidazolc pH8.0) 缓冲液中,震荡离心4'C离心收集菌体,以去除LB液体培养基残留；将沉淀后菌泥重悬于以上同样溶液中，在上述重悬中加入终浓度为2mM DTT、1mM PMSF利0.5mM EDTA,采用HN92‑II超声破碎仪,Q6号变辐杆,冰浴、功率400伏、超声4S、间息5s,30个循环、循环五次,再4℃、10000rpm离40分钟,取上清,采用0.45μm过滤器过滤除颗粒,‑20℃冻存待用；然后再采用APPS MV 50D蛋白纯化仪器对过滤后的上清进行纯化，100ml上样，用溶液(50mM NaH2P04,500mM KC1,20mM Imi dazole, 2mM DTT pH8.0) 洗涤到基线，Protio@NI‑NTA 10ml预装亲和柱咪唑梯度洗脱;Sephdex G‑25脱盐柱脱盐;SP阳离子柱离子梯洗脱; Superdex 200分子筛柱分离;50ml的50KD超滤管浓缩,再加入终浓度为50%的甘油、0.5% Tween‑20、0.5% NP‑40和200μg/ml BSA，得到6ml (2.5mg/ml) 融合酶蛋白。