[发明专利]一种沉默T1蛋白的重组病毒及其构建方法与应用

摘要

本发明涉及一种沉默T1蛋白的重组病毒及其构建方法与应用，属于生物医药技术领域。首先设计合成沉默T1蛋白的shRNA并将其导入病毒载体中，然后包装制得沉默T1蛋白的重组病毒。所述重组病毒能在小鼠体内高效感染主动脉内皮并在主动脉内皮细胞中长期表达，能保护动脉粥样硬化模型小鼠内皮屏障完整和促进内皮钙粘蛋白的表达，能显著抑制动脉粥样硬化的发展。本发明的沉默T1蛋白的重组病毒有望成为治疗动脉粥样硬化相关疾病的基因药物。

主权项

1.一种沉默T1蛋白的重组病毒的构建方法，包括以下步骤：(1)根据T1的mRNA设计并合成shRNA序列，其中shRNA的上游核苷酸序列mT1‑shRNA‑F如SEQ ID NO.1所示，shRNA的下游核苷酸序列mT1‑shRNA‑R如SEQ ID NO.2所示；(2)将步骤(1)中mT1‑shRNA‑F和mT1‑shRNA‑R经退火处理，得mT1‑shRNA退火产物；(3)限制性内切酶BamHI和HindⅢ酶切质粒载体pAAV‑ZsGreen‑shRNA，纯化回收6000bp大片段得pAAV‑ZsGreen酶切产物；(4)将步骤(2)的mT1‑shRNA退火产物与步骤(3)的pAAV‑ZsGreen酶切产物连接，连接产物转化感受态细胞，筛选鉴定阳性克隆，抽提阳性质粒pAAV‑ZsGreen‑shRNA‑T1；(5)复苏293AAV细胞，将步骤(4)的阳性质粒pAAV‑ZsGreen‑shRNA‑T1和辅助质粒pAAV9、pHelper共同转染复苏的293AAV细胞，转染后收集上清，浓缩纯化，获得沉默T1蛋白的重组病毒。