[发明专利]一种DNA病毒重组体的构建方法

摘要

本发明公开了一种DNA病毒重组体的构建方式，属于生物技术领域。本发明所述的DNA病毒重组体的构建方式，具体包括如下步骤：1）PCR分别扩增置换位点基因两侧翼1000‑2000bp的同源片段；2）以含GFP基因的质粒为模版扩增GFP荧光蛋白全基因序列；3）置换同源质粒的构建；4）GFP荧光病毒的构建；5）病毒重组体的构建。本发明通过In‑fusion技术大大简化了构建重组病毒的步骤，使得本发明的构建方法实现DNA重组病毒的快速构建，同时不引入其他的外源核酸片段。该方法适用于抗肿瘤基因病毒治疗，病毒学研究，病毒载体开发，以及疫苗研究等需要构建DNA病毒重组体的各种情况。

主权项

1.一种DNA病毒重组体的构建方式，其特征在于，具体包括如下步骤：1）PCR分别扩增置换位点基因两侧翼1000‑2000bp的同源片段；提取DNA病毒核酸，设计引物对A和引物对B的两对引物分别扩增置换位点上下游的左侧翼a和右侧翼b同源片段；引物的设计为左侧翼a的上游引物含有质粒末端的15bp序列，右侧翼b的下游引物含有质粒另一个末端的15bp序列；2）以含GFP基因的质粒pEGFP为模版扩增GFP荧光蛋白全基因序列；其中上下游引物分别含有左右侧翼末端的15bp；3）置换同源质粒的构建按In‑fusion试剂说明书的要求将病毒基因同源的左侧翼a和右侧翼b的2个PCR扩增片段，GFP荧光蛋白全基因序列，线性化质粒pUC19，及In‑fusion试剂混合配制10微升反应体系，50℃孵育15min；所有需要连接的DNA片段在In‑fusion试剂处理前，需要做DNA片段的纯化；经转化筛选获得包含同源片段及GFP片段的目的质粒pUC19‑GFP‑ab；4）GFP荧光病毒的构建目的质粒pUC19‑GFP‑ab在转染细胞前需要用内切酶酶切进行线性化；用病毒多重感染度MOI 0.1感染细胞，孵育1小时后用Opti‑MEM medium清洗细胞；加入线性化pUC19‑GFP‑ab DNA和lipofetamine 2000的混合物，孵育2小时后，去除DNA混合物，加入含5%FBS的细胞培养基；病变细胞达到90%时，回收病毒上清液，将回收的病毒上清做适当稀释，感染平板内培养好的细胞，使直径9cm平板内病毒的个数为200‑300个；病毒吸附1小时后除去病毒液，加入含有5%FBS，及1.5%甲基纤维素的细胞培养基；2‑3天后，在荧光显微镜下，寻找发绿色荧光的病毒，用200微升枪头将发光病毒空斑及周围的细胞吸走，放入已准备好的1ml培养基中，‑80℃保存；保存的含有荧光病毒的培养基经3次冻融之后，重新感染细胞，进行第2次的空斑纯化；经3次的空斑纯化可获得纯的GFP荧光病毒；5）缺陷病毒重组体的构建设计引物扩增病毒缺陷基因左侧翼a，上游引物含有质粒末端的15bp，下游引物含有右侧翼b的末端15bp序列；右侧翼b扩增所使用引物同步骤1）；将1000‑2000bp长度的a和b片段通过in‑fusion试剂连接并插入线性化载体pUC19中，构建pUC19‑ab；后续的操作同上；如果要在病毒基因组中插入外源序列，则同步骤1）和2）分别设计引物扩增外源片段，及左右侧翼同源片段a和b；同样通过in‑fusion试剂将同源左侧翼a，外源基因，右侧翼b连接并插入载体pUC19中，转染感受态细菌；将获得的质粒同样线性化后，转染感染上述步骤4）获得的荧光GFP病毒的细胞中，转染步骤同步骤4）相同；90%细胞出现病变之后回收病毒上清液；同步骤4）中荧光病毒空斑纯化方法一样，此次依然在荧光显微镜底下进行非荧光空斑的纯化；在绿色荧光显微镜下，可见不发光的空斑，即为目的重组病毒。