[发明专利]一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法

摘要

本发明公布了一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法。该方法结合肿瘤单细胞的群体多态性位点信息以及基因组拷贝数变化信息分析，充分考虑到单细胞扩增技术可能引入的随机碱基替换及相应基因组扩增和测序技术可能引入的系统性偏差，提高了体细胞突变检测的准确率，对肿瘤基因组的异质性描述以及肿瘤基因组演化信息有着重要的意义。

主权项

1.一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法，包括以下步骤：1)取同一病例的至少四个肿瘤单细胞，并以该病例的至少一个正常组织单细胞和正常组织大量细胞为对照样本，同时进行全基因组或者全外显子高深度测序，其中单细胞样本需要进行单细胞扩增后再测序；2)对测序数据进行质量过滤，并去除单细胞扩增引物污染，包括：(i)容忍一定比例碱基错配去除测序序列5’端单细胞扩增引物；(ii)容忍一定比例碱基错配去除3’端反向单细胞扩增引物及测序引物，同时，如果在3’端有相应引物污染则3’端多去除1个碱基；3)将步骤2)处理后的序列与参考基因组比对，根据染色体坐标顺序对比对结果进行排序，并去除PCR形成的重复序列，其中对于全外显子高深度测序数据还需要使用突变检测软件对比对结果进一步进行indel重比对和碱基质量矫正；4)通过群体多态性位点检测方法进行SNV/INDEL突变检测；5)根据突变检测结果对源自肿瘤单细胞的体细胞突变进行过滤，获得初步的sSNV/sINDEL，过滤原则是：a.过滤掉在正常组织大量细胞测序结果中覆盖度过低的位点；b.过滤掉在正常组织大量细胞中有突变的位点；c.过滤掉在正常组织单细胞中有突变的位点；d.根据多个肿瘤单细胞突变情况，保留在三个或者三个以上肿瘤单细胞中出现的突变位点；6)对步骤5)的过滤结果进行位点基因功能注释和数据库注释，根据一定过滤标准过滤掉人群中广泛存在的多态性位点并且在肿瘤突变数据库中注释出高频突变位点，提取出其中会影响到基因编码功能的sSNV/sINDEL；7)对步骤6)提取出的sSNV/sINDEL再进行具体位点序列覆盖状况分析，过滤在多数样本中覆盖序列质量普遍较低，邻近区域突变异常频繁或者所有发生在序列起始位置的突变，从而得到最终的肿瘤单细胞的体细胞突变结果。