[发明专利]一种γδT细胞的培养方法

摘要

本发明提供了一种γδT细胞的培养方法，包括如下步骤：(1)从外周血中获得单个核细胞，用额外添加有抗体的无血清培养基重悬后，调整单个核细胞密度，培养箱培养；(2)第4天和第8天，分别补加不添加抗体的无血清培养基；第12天，扩增培养结束；(3)对T细胞筛选，将分选后的γδT细胞转移至细胞培养瓶，补加γδT细胞培养基；(4)第4天和第8天，分别补加γδT细胞培养基；第12天，扩增培养结束；(5)收集γδT细胞。本发明的优点为：提供了一种专门针对γδT细胞的细胞培养方法，扩增γδT细胞12天，扩增倍数达到60倍，培养出的γδT细胞对K562肿瘤细胞的杀伤活性在25:1时达到90％以上。

主权项

1.一种γδT细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)外周血单个核细胞的制备从150‑250mL外周血中分离获得单个核细胞，用添加有anti‑CD3antibody与anti‑CD28antibody的无血清培养基充分重悬后，调整单个核细胞密度为(2‑3)x106细胞/mL，再将装有上述培养液的细胞培养瓶于培养箱中培养3天；(2)T细胞的扩增培养第4天，向细胞培养瓶中补加50‑100mL不添加抗体的无血清培养基；第8天，向细胞培养瓶中补加100‑200mL不添加抗体的无血清培养基；第12天，T细胞扩增培养结束；(3)γδT细胞的筛选使用γδT细胞阳性筛选试剂盒对上述T细胞进行筛选，将分选后的γδT细胞转移至新的细胞培养瓶中，并补加γδT细胞培养基，再于培养箱中培养3天；其中，γδT细胞培养基具体为添加有5‑15mg/L转铁蛋白、5‑15％人AB血清或自体血浆或胎牛血清FBS、100‑200mMβ‑巯基乙醇、5‑15mg/L胰岛素、50‑200U/mL IL‑2、50‑200U/mL IL‑4、2‑5mM丙酮酸钠和100‑200uM异戊烯焦磷酸的RPMI‑1640培养基；(4)γδT细胞的扩增培养第4天，向细胞培养瓶中补加50‑100mLγδT细胞培养基；第8天，向细胞培养瓶中补加100‑200mLγδT细胞培养基；第12天，γδT细胞的扩增培养结束；(5)离心收集γδT细胞离心收集γδT细胞，同时使用流式抗体鉴定γδT细胞表型。