[发明专利]传代细胞源ND、IB、AI三联灭活疫苗的制备方法及其应用

摘要

本发明提供了一种传代细胞源鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法及其应用，包括步骤如下：取EB66细胞于生物反应器中进行生长培养，用于病毒接种；采用二阶培养法，向EB66细胞接种新城疫病毒、传染性支气管炎病毒或禽流感病毒；在接毒24h后，病毒EID₅₀达到最高时收获病毒并保存，得到病毒液；重复上述步骤以分别获得新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液并灭活；将灭活后的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液混合，制备灭活疫苗。本发明采用EB66传代细胞系进行鸡新城疫病毒、传染性支气管炎和禽流感病毒的培养，避免了使用鸡胚造成胚体异源蛋白和外源病毒污染的风险，提高病毒的生产品质，简化病毒的生产工艺。

主权项

1.一种传代细胞源鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述灭活疫苗的制备方法包括步骤如下：步骤1：取EB66细胞于生物反应器中进行生长培养，当EB66细胞密度达到6×106cells/mL‑15×106cells/mL时，用于病毒的接种；所述EB66细胞的培养温度为35℃‑37℃，培养转速为130rpm‑150rpm；步骤2：采用二阶培养法，向EB66细胞接种传染性支气管炎病毒、新城疫病毒或禽流感病毒，所述病毒的接毒量为0.0001MOI‑1MOI，细胞接毒后33℃‑35℃的培养温度下以110rpm‑140rpm的培养转速进行吸附，吸附0.5h‑2h，补加TPCK胰酶，所述补加TPCK胰酶的方法为：接种病毒为禽流感病毒，TPCK胰酶的补加方法为禽流感病毒在接毒后的第0天和第1天各补加2mg/L的TPCK胰酶；或接种病毒为新城疫病毒，TPCK胰酶的补加方法为新城疫病毒在接毒后的第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶；或接种病毒为传染性支气管炎病毒，TPCK胰酶的补加方法为在传染性支气管炎病毒接种后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶。；步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的EID50，在病毒EID50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的病毒液；步骤4：重复步骤1‑3以分别获得新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液，将收获的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液分别进行灭活；步骤5：将灭活后的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液混合，并制备灭活疫苗。