[发明专利]一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒，先从血清中提取总甲状腺激素，对血清中的总甲状腺激素进行SPTPP衍生化，然后再利用超高效液相色谱‑串联质谱(UPLC‑MS/MS)进行检测。与传统方法相比，本发明仅利用10μL血清样品，即可高效精准检测血清总甲状腺激素浓度，灵敏度极高、抗干扰能力强，可最大程度保证样品的有效回收与高重复性。 1

主权项

1.一种测定血清中总甲状腺激素的方法，包括：首先提取待测血清中的总甲状腺激素，然后将总甲状腺激素提取液进行SPTPP衍生化，再对SPTPP衍生化产物进行UPLC‑MS/MS检测，完成对血清中总甲状腺激素的测定。

2.如权利要求1所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述总甲状腺激素包括甲状腺激素T4、T3或者甲状腺激素T4、T3和rT3。

3.如权利要求1所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，通过以下方法提取待测血清中的总甲状腺激素：10‑50μl待测血清加入等体积的甲醇内标溶液和1‑5μl抗氧化剂，混匀置于‑20‑0℃环境下，15分钟后取出；大于8000g离心力，离心5‑15分钟，取上清液即得甲状腺激素提取液。

4.如权利要求3所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述抗氧化剂为柠檬酸、抗坏血酸和二硫苏糖醇的混合水溶液，混合水溶液中各物质浓度均为50g/L；所述甲醇内标溶液为甲状腺激素¹³C₆‑T4浓度为3ng/mL的甲醇内标溶液。

5.如权利要求1所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述SPTPP衍生化包括：向300μl衍生反应缓冲溶液中加入10‑20μl总甲状腺激素提取液，加入50μl衍生试剂，密封涡旋混匀，40℃衍生化反应10分钟，反应结束后立刻将其置于冰上同时加入衍生反应终止溶液700μl终止反应。

6.如权利要求5所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述衍生试剂为10mM SPTPP的甲醇溶液；所述衍生反应缓冲溶液为pH 8.0的0.1M的磷酸缓冲液；所述衍生反应终止溶液为含有0.1％甲酸的乙腈：水＝1:3溶液。

7.如权利要求1所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，还包括进行UPLC‑MS/MS检测前，将SPTPP衍生化产物用乙酸乙酯萃取，收集的萃取液用氮气吹干再用甲醇定容，用于UPLC‑MS/MS检测。

8.如权利要求1‑7任一项所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述UPLC‑MS/MS检测的具体步骤为：取SPTPP衍生化产物和不同甲状腺激素不同浓度梯度的空白血清基质标准溶液，通过UPLC‑MS/MS进行测定，依据内标法，以内标矫正的峰面积对其进行相应浓度线性回归分析，计算待测血清中总甲状腺激素的浓度。

9.如权利要求8所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，通过以下方法配制不同甲状腺激素不同浓度梯度的空白血清基质‑SPTPP衍生混合标准曲线溶液：

(1)分别称取10mg的不同甲状腺激素，用甲醇定容至10mL，制得浓度均为1000μg/mL的标准储备液；

(2)分别取步骤(1)中的各标准储备液，混合，配制不同甲状腺激素浓度均为10μg/mL的混合标准溶液；

(3)取步骤(2)中的混合标准溶液，加入活性炭去除甲状腺激素的空白血清基质中，配制浓度梯度为0.250ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL和150ng/mL的工作溶液，分别进行SPTPP衍生化反应，获得不同甲状腺激素不同浓度梯度的空白血清基质‑SPTPP衍生混合标准曲线溶液。

10.一种测定血清中总甲状腺激素的试剂盒，包括：

用于提取血清中甲状腺激素的试剂，又包括：甲醇内标溶液和抗氧化剂，所述甲醇内标溶液为甲状腺激素¹³C₆‑T4浓度为3ng/mL的甲醇内标溶液，所述抗氧化剂为柠檬酸、抗坏血酸和二硫苏糖醇的混合水溶液，混合水溶液中各物质浓度均为50g/L；

以及用于对甲状腺激素进行SPTPP衍生化的试剂，又包括：衍生反应缓冲溶液、衍生试剂和衍生反应终止溶液，所述衍生试剂为10mM SPTPP的甲醇溶液，所述衍生反应缓冲溶液为pH 8.0的0.1M的磷酸缓冲液，所述衍生反应终止溶液为含有0.1％甲酸的乙腈：水＝1:3溶液。