[发明专利]一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法

摘要

一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法，其属于荧光检测的技术领域。该方法涉及到两种荧光染料，染料A是一种高度水溶性并且对膜结构没有亲和性的染料，作为实验过程中的内参。染料B是一种特异性免洗的膜染料，染料B可以与亲脂性的膜结构结合后会表现出强烈的发光性质,而在没有与亲脂性的膜结构结合的水环境中由于其疏水性而发生聚集而无荧光。本发明提供一种外泌体快速定量的方法，基于两种荧光染料的比率定量，成功实现了生物样品中外泌体的测定。该方法具有效率高，成本低，操作方便，测定结果准确性高等优点。有望在外泌体相关研究中得到广泛的应用。该方法应用于细胞培养基、唾液、血清、尿液、乳液。

主权项

1.一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制染料母液

将染料A配制成100‑200μM的DMSO的母液，将染料B配制成1‑2mM的DMSO的母液；所述染料A为A‑1、A‑2或A‑3，染料B为B‑1、B‑2、B‑3、B‑4、B‑5、B‑6或B‑7；

所述染料A和染料B的结构如下：

染料A：

染料B：

(2)标准曲线的制备

在10‑50ug/uL的浓度范围内，制备5‑15份不同浓度的一系列外泌体标准液；向一系列外泌体标准液中加入染料A的母液和染料B的母液，使得染料A的浓度为100‑200nM，染料B的浓度为1‑2uM；混匀室温下反应后，测定染料A以及染料B的荧光光谱，以染料B与染料A最大发射处的荧光强度的比率值作为纵坐标，标准外泌体溶液的浓度作为横坐标，制作标准曲线；

(3)待测外泌体样品的浓度

向待测外泌体的样品加入加入染料A的母液和染料B的母液，使得染料A的浓度为100‑200nM，染料B的浓度为1‑2uM；混匀室温下反应后，测定染料A以及染料B的荧光光谱，得到染料B与染料A最大发射处的荧光强度的比率值，带入标准曲线方程，得到待测外泌体样品的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)荧光染料母液的配制

染料A母液的配制：配制染料A‑1的DMSO母液100μM。

染料B母液的配制：配制染料B‑1的DMSO母液1mM。

(2)标准曲线的制备

分别取外泌体标准液0、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250μL，依次配成浓度为0、4.52、9.04、13.56、18.07、22.59、27.10、31.62、36.14、40.66、45.18μg/μL外泌体标准液；分别加入染料A‑1母液，使染料A‑1溶液的浓度为100nM；加入染料B‑1母液，使染料B‑1溶液的浓度为1μM；震荡均匀后室温下反应10min，测定染料A‑1和染料B‑1的荧光光谱；染料B‑1在615nm处的的荧光强度与染料A‑1在584nm处的荧光强度的比率值作为纵坐标，外泌体标准液浓度作为横坐标制作标准曲线，得到标准曲线方程为：y＝0.0315x+0.4824，R²＝0.965,其中x为0‑50ug/uL；

(3)外泌体样品的测定

取待测外泌体样品，依次加入染料A‑1母液，使染料A‑1溶液的浓度为100nM；加入染料B‑1母液，使染料B‑1溶液的浓度为1μM；震荡均匀后室温下反应10min,测定染料A‑1和染料B‑1的荧光光谱；计算出染料B‑1在615nm处的的荧光强度与染料A‑1在584nm处的荧光强度的比率值，根据荧比率值带入标准曲线得到待测外泌体样品的浓度。

3.根据权利要求1所述的一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法，其特征在于：该方法应用于细胞培养基、唾液、血清、尿液、乳液。