[发明专利]PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法

摘要

本发明公开了一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法，PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法包括(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSV N蛋白编码基因；(2)以MBP作为促溶标签，构建N蛋白原核表达载体；(3)MBP融合N蛋白表达与纯化；再通过间接ELISA抗体检测方法进行特异性试验。本发明以带有MBP标签的PMAL‑C4X作为表达载体，实现了PRRSV N蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，诱导培养在接近室温进行，无需加热或降温设备，目的蛋白洗脱采用10mmoL/L麦芽糖溶液，洗脱效果好，用量少，节约成本。本发明以融合N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法特异性强；本发明建立间接ELISA抗体检测方法与IDEXX同类试剂盒的总符合率为90％左右。

主权项

1.一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSV N蛋白编码基因，所述PRRSV N蛋白编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；(2)以MBP作为促溶标签，构建N蛋白原核表达载体设计PCR引物，对所述合成的PRRSV N蛋白编码基因进行PCR扩增，所述引物序列如下：上游引物为F：5'‑CGGAATTCATGCCAAATAACAACGGCAAG‑3'，下划线为EcoRⅠ酶切位点；下游引物为R：5'‑AACTGCAGTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG‑3'，下划线为PstⅠ酶切位点；PCR扩增反应体系为：按体积百分含量计，Ex‑Taq预混酶50％、上游引物和下游引物各3％、模板2％、余量为蒸馏水；利用EcoRⅠ和PstⅠ分别双酶切PCR产物和带有MBP标签的PMAL‑C4X载体，反应体系为：按体积百分含量计，胶回收产物12.5％，线性化后PMAL‑C4X载体50％，10x Buffer H10％，EcoRⅠ5％，PstⅠ5％，余量为ddH₂O；筛选阳性重组质粒；(3)MBP融合N蛋白表达与纯化将(2)中筛选的阳性重组质粒转入培养液中诱导表达；再进行裂解、离心，将直链淀粉树脂加入到层析柱中，用缓冲液洗涤树脂，然后将离心收集的上清液加入到层析柱中进行分离纯化，最后加入麦芽糖溶液洗脱目的蛋白，将麦芽糖用PBS置换。