[发明专利]一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法以及试剂盒在审
| 申请号： | 201810163345.7 | 申请日： | 2018-02-27 |
| 公开（公告）号： | CN108486140A | 公开（公告）日： | 2018-09-04 |
| 发明（设计）人： | 庞一林;谭国强;吕建新;李江辉;李唐;张涛;孙倩倩;韩琴霞 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/66 |
| 代理公司： | 温州匠心专利代理事务所(特殊普通合伙) 33279 | 代理人： | 胡仁勇 |
| 地址： | 325000 浙江省温州市瓯海*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明提供一种基于无缝克隆技术的快速克隆载体、该载体的制备方法以及含有该载体的试剂盒。所述克隆载体的制备方法包括：PCR扩增获得目的基因，PCR产物的特征在于其两末端从外到里依次为任意大肠杆菌表达载体的多克隆位点中单一限制性内切酶酶切位点上/下游15‑20bp的同源序列和同一限制性内切酶识别序列；采用TA克隆的方法构建重组质粒；经同一限制性内切酶切割，回收T载体大片段，采用T4DNA连接酶使其自连后构建了pWMU‑19T系列载体。本发明所述克隆载体相对TA克隆载体具有PCR产物无需加A反应，30min即可完成载体构建，无需蓝白斑筛选阳性克隆，且阳性克隆率大于90％，并可实现高通量构建的技术优势。 | ||
| 搜索关键词： | 克隆载体 制备 阳性克隆 试剂盒 构建 限制性内切酶酶切位点 限制性内切酶识别序列 克隆 大肠杆菌表达 构建重组质粒 限制性内切酶 多克隆位点 蓝白斑筛选 技术优势 目的基因 同源序列 载体构建 高通量 切割 大片 回收 | ||
【主权项】：
1.一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法，其特征在于：通过设计一对如图2所示的从引物5′至3′端依次为15‑20bp同源臂序列、同一限制性内切酶识别位点和目的基因编码框扩增序列的引物扩增目的基因，其PCR产物经加A反应后，连接至pUM19‑T出发载体中构建重组克隆载体；采用同一限制性内切酶单酶切重组克隆载体，回收载体片段，使用T4连接酶使其自连后构建前克隆载体；采用同一限制性内切酶单酶切前克隆载体，回收后载体片段即为本发明所述克隆载体。
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