[发明专利]一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法

摘要

本发明涉及一种利用构建含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，属于基因工程领域。本发明以低油酸花生的△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B为标记基因，构建了一种含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体，实现了花生内源基因在遗传转化后代的快速筛选中的应用，该方法通过花生种子单粒近红外检测，可以在不损伤种子的条件下，快速、高效的筛选出转化体。本发明避免了利用抗生素筛选存在的假阳性、步骤繁琐和安全隐患等问题，而且转化效率高，操作简单，是一种安全、高效的筛选方法。

主权项

1.△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B作为标签在筛选转基因花生中的应用，所述△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述应用为一种利用构建含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，包括以下步骤：(1)构建获得含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的植物表达载体，将目的基因插入到含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的植物表达载体中，得到含有目的基因的重组表达载体，其中△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)将步骤(1)中得到的含有目的基因的重组表达载体转入高油酸花生，通过单粒近红外技术检测转化后代种子的油酸含量；其中，所述转入采用农杆菌介导的花萼管注射法；(3)当转化后代种子的油酸含量值≤65％时，转化后代种子为转化成功的转基因花生；其中，含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的植物表达载体的构建方法包括以下步骤：a、以AhFAD2A和AhFAD2B均未发生突变的普通油酸花生基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B，其中上游引物FAD2B‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物FAD2B‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；b、将步骤a中扩增的AhFAD2B基因连接到pMD18‑T载体上，得到AhFAD2B‑pMD18‑T重组质粒；c、设计同源臂引物，扩增步骤b中AhFAD2B‑pMD18‑T重组质粒，获得含有同源臂的AhFAD2B基因，其中上游同源臂引物FAD2B‑CZ‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游同源臂引物FAD2B‑CZ‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；d、内切酶XhoI单酶切植物表达载体pCAMBIA2300‑35s‑ocs，将新霉素磷酸转移酶II基因NeoR切掉；e、利用同源重组的方法，将步骤c中含有同源臂的AhFAD2B基因与步骤d中酶切后的植物表达载体进行重组，获得含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体。