[发明专利]一种基于三代测序平台的HLA基因分型方法

摘要

本发明公开了一种基于三代测序平台的HLA基因分型方法，包括以下步骤：(1)对需要分型的HLA基因进行PCR扩增；(2)PCR所得产物检测合格后，进行三代测序，获得原始数据；(3)将原始数据与参考基因序列进行长序列比对；(4)比对后对测序错误进行矫正；(5)分相得到单体型序列；(6)分型判断。相比于现有的HLA基因分型方法，本发明的HLA分型方法对计算资源要求少、分型快、分辨率高，对临床移植组织配型、群体遗传学、人类学和进化学等应用和基础研究工作具有重要价值。

主权项

1.一种基于三代测序平台的HLA基因分型方法，包括以下步骤：(1)对需要分型的HLA基因进行PCR扩增；(2)PCR所得产物检测合格后，进行三代测序，获得原始数据；(3)将原始数据与参考基因序列进行长序列比对，所述参考基因序列为IPD‑IMGT/HLA数据库中的一条最长序列；(4)比对后采用如下程序对测序错误进行矫正：(4.1)编码原始比对矩阵经过和参考序列的比对，所述HLA基因组成了由碱基构成的特有矩阵；使用samtools软件的tview命令，输出文本格式的碱基与参考基因序列的比对矩阵；以参考基因的位置为横坐标、以i表示，以深度为纵坐标、以j表示，矩阵组成单元以x表示；设置初始阈值y，所述y表示默认的错误率，所述错误率为测序错误占总深度的比例，所述错误率为10％；每个i位置的碱基纵向的总深度为Dep_total[i]；统计每个i位置对应的所有j位置x的数量Num(x)，计算x对应的深度Dep(x)；(4.2)纯合、杂合位点的可视化矫正(4.2.1)设置初始错误率阈值y，所述y为10％；(4.2.2)确定扩增子杂合等位型j位置及比例；对于每个i位置，当Dep(x)>y，使用Dep(x1)代表最大深度碱基类型的深度，仅次于Dep(x1)的深度，用Dep(x2)表示，若有第三大碱基类型的深度，为Dep(x3)；对整个扩增子的杂合比例进行计算，当Dep(x2)/(Dep(x1)+Dep(x2))<20％时，假设其为纯合子；当Dep(x2)/(Dep(x1)+Dep(x2))>＝20％时，假设其为杂合二倍型别，选取SNV等位型杂合比最接近0.5的四个点，该四个点依照以下规则选取：以δi衡量SNV等位型杂合比与0.5的接近程度，δi＝(Dep(x1)/Dep_total[i]‑0.5)2+(Dep(x2)/Dep_total[i]‑0.5)2；选取δi最小的四个i位置；且该四个位置前后两个位置的Dep(*)小于总深度的20％，否则继续根据δi筛选；根据该四个i位置确定矩阵中每个j位置的连锁相：(4.2.2.1)对于矩阵中该四个杂合位点，第一个杂合位点i位置最大深度Dep(x1)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位1，第二大深度Dep(x2)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位2，确定第一个杂合位点的不需要矫正的j坐标的相位；(4.2.2.2)第二个杂合位点的相位根据第一个杂合位点的每一个j坐标的相位情况确定：若相位1对应的碱基类型有80％为该i位置的最大深度Dep(x1)的碱基类型，且相位2对应的碱基类型有80％为该i位置的第二大深度Dep(x2)的碱基类型，则最大深度Dep(x1)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位1，第二大深度Dep(x2)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位2；若相位1对应的碱基类型有80％为该i位置的最大深度Dep(x2)的碱基类型，且相位2对应的碱基类型有80％为该i位置的最大深度Dep(x1)的碱基类型，则第二大深度Dep(x2)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位1，最大深度Dep(x1)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位2；若满足以上两个条件，则根据该方法确定其它杂合位点的连锁相；若以上两个条件不都满足，继续根据第三个位点分别和第一个杂合位点、第二个杂合位点进行判断；满足(4.2.2.2)所述要求的位点，共同确定连锁相，不满足(4.2.2.2)所述要求的位点被作为纯合位点；第四个i位置，依照此方法，对前面三个点进行验证和对不确定相位的j位置补缺；对于该四个杂合位点，相位1对应的j位置组成数组j(phase1)，相位2对应的j位置组成数组j(phase2)；以相位1对应的基因型的深度为Dep(phase1)，以相位2对应的基因型的深度为Dep(phase2)，计算杂合基因型的比例Rh：Rh＝Dep(phase1)/[Dep(phase1)+Dep(phase2)]；(4.2.3)确定纯合位点与杂合位点；对于每个i位置，满足以下任意一种情况，则为杂合位点：①Dep(x1)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase1)，Dep(x2)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase2)；②Dep(x1)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase2)，Dep(x2)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase1)；否则为纯合位点；根据矩阵中杂合位点j位置的连锁相的判断，对纯合、杂合位点再次验证调整；初步确定该扩增子或基因为纯合单体型还是杂合二倍型；(4.2.4)碱基矫正对于纯合位点，该i位置调整y＝Dep(x2)；当Dep(x)<＝y，则该处ij坐标的碱基被矫正为最大深度Dep(x1)的碱基类型；对于杂合位点，该i位置调整y＝Dep(x3)；当Dep(x)<＝y，则该处ij坐标将根据其连锁相，从而决定该处ij坐标的碱基被矫正为最大深度Dep(x1)的碱基或第二大深度Dep(x2)的碱基；(4.2.5)输出后验矩阵(5)分相得到单体型序列对矫正后的矩阵进行序列读取；根据(4.2.3)确定该扩增子为纯合单体型或杂合二倍型，若为纯合单体型，输出最大深度的一条单体型序列；否则根据(4.2.3)确定的每个j位置的连锁相，对校正后的序列按照相位1和相位2归类；输出最大深度的两条单体型序列，以两条单体型序列深度为单位，和对应(4.2.2.2)中的Dep(phase1)、Dep(phase2)进行卡方检验，确定该扩增子为纯合单体型或杂合二倍型，输出一致性序列；(6)分型判断(6.1)根据比对位置，确定单体型序列的每个外显子编号及对应的碱基序列；对于每条单体型序列，根据外显子匹配度输出完全匹配结果result1，否则输出最佳匹配的6位分型结果result1，同时打印该基因突变或gap处的位置和突变类型，并标记为新的型别，作为result1；(6.2)进一步对单体型全长匹配打分若IPD‑IMGT/HLA数据库中基因全长序列文件hla_gen.fasta，有result1的分型，则将单体型中内含子的序列，与数据库中的参考序列进行匹配打分；给出最佳8位分型结果result2，若突变则同时打印该基因突变或gap处的位置和突变类型，并标记为新的型别result2。