[发明专利]一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法在审
| 申请号： | 201810233479.1 | 申请日： | 2018-03-21 |
| 公开（公告）号： | CN108486053A | 公开（公告）日： | 2018-09-04 |
| 发明（设计）人： | 杨文君;其他发明人请求不公开姓名 | 申请（专利权）人： | 浙江康佰裕生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/0783 | 分类号： | C12N5/0783 |
| 代理公司： | 杭州杭诚专利事务所有限公司 33109 | 代理人： | 尉伟敏 |
| 地址： | 310051 浙江省杭州市滨江区浦*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明涉及细胞扩增培养技术领域，公开了一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，包括：1）用肝素钠对全血抗凝，用PBS稀释；2）将稀释后的抗凝全血平铺加到淋巴细胞分离液的液面上；3）离心，吸取白膜层，将其吹打混匀，离心，弃上清液，重复洗涤；4）去除CD3+淋巴细胞，对外周血单核细胞抗体染色，分选细胞；5）将CD3‑淋巴细胞稀释，加入IL‑2、IL‑15、IL‑21和IL‑7，进行扩增。本发明在扩增前剔除CD3+细胞，极大降低了细胞免疫原性，同时用4种特定细胞因子按特定配比实现了对NK细胞的激活和扩增，既保证了NK细胞的扩增倍数，又大幅提高了NK细胞在治疗中的安全性。 | ||
| 搜索关键词： | 扩增 淋巴细胞 高效体 外周血 外扩 稀释 淋巴细胞分离液 细胞免疫原性 血单核细胞 细胞 抗凝全血 细胞扩增 细胞因子 吹打 白膜层 肝素钠 上清液 染色 分选 混匀 抗凝 抗体 配比 平铺 去除 全血 洗涤 剔除 激活 重复 治疗 保证 | ||
【主权项】：
1.一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：1）无菌状态下，取全血并用肝素钠抗凝，得到抗凝全血，然后用PBS稀释抗凝全血；2）另取淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝全血缓慢平铺加到淋巴细胞分离液的液面上，保持两液面界面清晰；3）对步骤2）所得液体离心处理，吸取血浆层与淋巴细胞分离液层之间一层薄而致密的白膜层，将白膜层置于另一离心管中，用MACS 吹打混匀，离心处理，弃上清液，再用MACS 重复洗涤至少2次；4）利用磁珠分选法去除CD3阳性（CD3+）淋巴细胞，外周血单核细胞用CD3‑beads抗体染色后，将细胞加于MACS柱子中进行分选细胞，获得CD3阴性（CD3‑）淋巴细胞；5）用FBS/RPMI 1640将CD3‑淋巴细胞稀释至浓度为1*104/mL，取24孔板，在每孔中加入1mL细胞，同时加入10‑50 ng/mL的IL‑2、10‑50 ng/mL的IL‑15、10‑50 ng/mL的IL‑21和 10‑50 ng/mL的IL‑7，进行扩增NK细胞。
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