[发明专利]一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的高效制备方法

摘要

本发明公开了一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的高效制备方法，包括材料和制备工艺。本发明采用A群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物和白喉CRM197蛋白为原料，采用碳二亚胺EDAC作为交联剂进行偶联，通过衍生物溶液预备、混合配比、结合反应、时效处理、超滤、纯化和除菌的工艺进行制备的技术方案，克服了现有技术存在效益低的问题与不足，通过提高多糖收率和蛋白收率，使A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的制备，达到了提高效益的目的。

主权项

1.一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的高效制备方法，包括材料和制备工艺，其特征在于：所述的材料为：衍生物，A群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物；载体蛋白，白喉CRM197蛋白，简称蛋白；交联剂，碳二亚胺EDAC；氯化钠，分析纯；盐酸，分析纯；蒸馏水，分析纯；所述的制备工艺为：衍生物溶液预备、混合配比、结合反应、时效处理、超滤、纯化、除菌；步骤一、衍生物溶液预备将所述衍生物放入烧杯中，采用水浴进行温控，温度控制在2～10℃范围内，搅拌调节pH值，使用0.2mol/l的氯化钠溶液和0.1mol/l的盐酸溶液调节衍生物溶液的pH值至6.00±0.50范围内；获得衍生物溶液；所述0.2mol/l的氯化钠溶液由所述氯化钠与所述蒸馏水调配而成；所述0.1mol/l的盐酸溶液由所述盐酸与所述蒸馏水调配而成；步骤二、混合配比温度控制在2～10℃的条件下，向烧杯内所述衍生物溶液中加入所述载体蛋白，搅拌混合，致烧杯中内容物的多糖与蛋白的比例达到1∶0.8～1∶2.5之间，多糖反应浓度在0.5～5mg/ml之间，获得平衡溶液；步骤三、结合反应温度控制在2～10℃的条件下，向烧杯内所述平衡溶液中加入所述交联剂，搅拌混合，致烧杯内容物中的交联剂的浓度达到10～100mmol/l，开始结合反应：反应温度保持在2～10℃，反应用时2～4小时，获得初反应物；步骤四、时效处理将烧杯连同所述初反应物置于2～8℃的冰箱中，静置18小时进行时效处理，获得时效反应物；步骤五、超滤将所述时效反应物，用超滤机和100kD的超滤膜包进行6次换液超滤，每次以所述时效反应物的5倍体积的所述蒸馏水进行稀释，除去结合反应过程中多余的残留试剂，之后，获得结合物浓缩液；步骤六、纯化用AKTApure 150M蛋白纯化仪对所述结合物浓缩液进行柱层析纯化，纯化填料为Sepharose 4 Fast Flow，纯化线性流速为30‑50cm/h，上样纯化体积不超过装柱体积的5％，收集V0附近kD≤0.2的A280吸收峰处的物质，获得结合物纯化液；步骤七、除菌：用0.22μm滤膜对所述结合物纯化液进行除菌过滤，获得A群脑膜炎球菌结合物制品。