[发明专利]高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用

摘要

本发明公开了一种高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用，涉及基因工程技术领域。本发明以pcDNA3.1(‑)质粒为骨架，将cumate‑cymR诱导表达调控单元装入pUC ori高拷贝复制子和Ampicillin抗性基因之间，同时将pET‑28a T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列插入cumate‑cymR调控单元的下游构建出高复制和高表达的重组质粒DN‑001。本发明的重组质粒DN‑001具有最经济、最方便和高产量等优点，使得基因表达载体的重组省时、省力；可以适用于生产大剂量的重组蛋白；同时有效地抑制了漏出表达，使得这一载体特别适合有毒蛋白的表达，使得这一载体具有广泛的市场前景。

主权项

1.高拷贝高表达重组质粒，其特征在于：所述重组质粒由pUC ori复制启动子、Ampicillin抗性基因、cymR基因、T5启动子、cym‑cmt操纵子、多克隆位点和His标签组成；所述重组质粒的构建包括如下步骤：SS01采用质粒pcDNA3.1(‑)为模板，PCR扩增出含pUC ori复制启动子和Ampicillin抗性基因的片段pUC‑Amp，设计引物为：pcDNA‑5:TCGACCTCTAGCTAGAGCTTpcDNA‑3:TATATGGGCTATGAACTAASS02基因合成由cymR基因表达盒、T5启动子、cym‑cmt操纵子和多克隆位点组成的cumate诱导表达DNA序列cymR‑cuo；SS03通过无缝连接将SS01得到的pUC‑Amp和SS02得到的cymR‑cuo两片段连接环合为原核系统表达载体DN‑002；SS04以质粒pET‑28a为模板，PCR扩增出含T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列的DNA片段M‑His‑T，设计引物为：pET‑5:CGCCCATGGTAACTTTAAGAAGGAGATpET‑3:CGCCTCGAGATCCGGATATAGTTCCTCSS05将步骤SS04中的DNA片段M‑His‑T和步骤SS03中的质粒DN‑002用Nco I和Xho I进行双酶切，试剂盒纯化回收后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒提取试剂盒提取重组质粒DN‑001，如SEQ ID NO1所示。