[发明专利]一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种血浆miRNA的qRT‑PCR检测方法，包括如下步骤：标本收集、滴加miRNA提取液、滴加氯仿、第一次离心、移液、滴加miRNA提取液和异丙醇、第二次离心、滴加乙醇、第三次离心、滴加RNase‑free水、配置加尾及逆转录反应体系、配置荧光定量PCR反应体系、进行定量检测、读取和记录数据和数据分析；本发明可以检测处血浆中的miRNA的各项参数，目前对miRNA参与这些复杂的基因调控和多种疾病的传导通路的具体机制还不太清楚，因此准确预测miRNA的靶基因并且对靶基因的传导通路进行系统的生物学分析也是研究其作用机制的重要环节，生物信息学分析可以有效的对miRNA靶基因进行预测并对其调控网络进行构建，为miRNA用于疾病的诊断提供理论依据。

主权项

1.一种血浆miRNA的qRT‑PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：1)标本收集：使用5mlEDTA真空采血管抽取空腹静脉血4ml，采血后轻轻颠倒试管，混合8‑10次，不得剧烈震荡，采完血样后样本垂直放置，使用台式低俗低温离心机3500rpm离心10min分离得到血浆，样本无肉眼可见溶血，剔除所有溶血可能的血浆样本，每200μL分装到一个冻存管，随后存放于‑80℃冰箱待用，尽量减少冻融次数，全程需在抽血后2小时内完成；2)滴加miRNA提取液：100μl血浆里加入1ml miRNA提取液，反复吹打至析出物完全溶解；3)滴加氯仿：加入200μl氯仿，盖紧EP管管盖，剧烈振荡20秒，室温静置5分钟；4)第一次离心：冷冻离心机12000g，4℃条件下离心15分钟，此时匀浆液分为三层：上层为含miRNA上清液，中间为白色蛋白层，下层为有色有机相；5)移液：吸取500μl上清液转移到新的EP管中；6)滴加miRNA提取液和异丙醇：加入5μl miRNA提取液和等体积的异丙醇(505μl)，上下颠倒充分混匀，‑20℃静置10分钟；7)第二次离心：冷冻离心机13500g，4℃条件下离心10分钟；8)滴加乙醇：弃上清，向沉淀加入1ml75％乙醇，轻缓颠倒清洗沉淀；9)第三次离心：冷冻离心机13500g，4℃条件下离心5分钟，弃上清；10)滴加RNase‑free水：室温干燥2‑3分钟，加入20μl RNase‑free水溶解；11)配置加尾及逆转录反应体系：将0.001‑1μg Total RNA，2.5μl 4×Reaction Buffer Mix，1μl PolyA/RT Enzyme Mix；1μl 10×miRNA RT primer**，6‑10μl RNase‑free Water和10μl Total volume混合均匀后，于37℃保温30min，42℃保温30min，75℃加热5min，冰上放置5min，制成加尾及逆转录反应体系；12)配置荧光定量PCR反应体系：将5μl 4×PCR Buffer，0.4μl HS SM‑Taq，0‑0.2μl Rox Reference Dye(100×)，1μl 20×probe&miRNA PCR primer，Xμl cDNA，10‑20μl dH2O和20μl Total volume混合均匀后，制成荧光定量PCR反应体系；13)进行定量检测：将处理后的血浆、加尾及逆转录反应体系和荧光定量PCR反应体系依次加入到八联管中，在95℃下反应3min，并循环反应1次，记录数据，接着再95℃下反应10s，并循环反应40次，记录数据，最后在60℃下反应30s，并循环反应40次，记录数据；14)读取和记录数据：每个反应重复三次,读取和记录数据；15)数据分析：对测试数据进行分析，确定测试结果。