[发明专利]一种肠道微生物基因组DNA的提取方法

摘要

本发明是一种肠道微生物基因组DNA的提取方法，具体步骤为：(1)粪菌样本采集；(2)菌体获得；(3)粪菌基因组DNA提取和纯化。本发明减少了有机溶剂的使用，成本低廉且提取的微生物总DNA纯度较高；异硫氰酸胍可以迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酶，得到的DNA质量高；能得到更加丰富的DNA种群信息，可更加全面地反映肠道微生物的多样性和群落结构组成，操作步骤较少，稳定性好，是一种实用可靠的粪便微生物DNA提取方法，可广泛应用于肠道微生态的研究。

主权项

1.一种肠道微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，具体步骤为：(1)粪菌样本采集对离心管进行灭菌处理；取样时手带一次性无菌手套，持灭菌后的离心管，探入粪便排泄物中，打开离心管盖，将粪便样本装入离心管中，离心管充满后立刻盖严，并迅速取出，做好标记和记录，直接投入干冰中冻存，之后置于‑80℃的环境中保存；(2)菌体获得取粪菌样品，然后向粪菌样品中加入经4℃预冷的PBS缓冲液，其中，加入的比例为每3克粪菌中加入10ml的PBS缓冲液，待样品融化后涡旋振荡1min，然后在4℃下采用1000r/min的速度离心5min，吸取上清液；样品重复震荡、离心、取上清液三次；将四次融化洗涤后所得上清液在4℃下采用12000r/min的速度离心10min，弃掉离心管上层清液，向每管底部沉淀均加入TE缓冲液，其中，TE缓冲液的体积与之前加入的PBS缓冲液的体积比为100：17；混匀后吸取液体至同一个灭菌离心管中，充分震荡混匀，形成细胞悬液；(3)粪菌基因组DNA提取和纯化取细胞悬液置于无菌管中加入经4℃预冷的PBS缓冲液，其中细胞悬液、PBS缓冲液的体积比为1：50；加入与细胞悬液等体积的无菌玻璃小珠、裂解液、酚氯仿，借助10ul枪头将细胞悬浮，然后涡旋震荡1min，放在冰上1min，重复四次；采用12000r/min的速度离心5min，吸取上清液，并在上清液中加入等体积的酚氯仿，颠倒混匀，去蛋白，再次采用12000r/min的速度离心5min；加入溶菌酶和异硫氰酸胍，其中，每1ul的细胞悬液加入15ug的溶菌酶和0.5ul的异硫氰酸胍，混匀后于37℃孵育1h；加入蛋白酶K，混匀后于37℃孵育1h；加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，抽提2次，在4℃下采用12000r/min的速度离心10min；收集上清液，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，在4℃下采用12000r/min的速度离心3min；吸取上清液，加入等体积的异丙醇，室温放置10min，采用12000r/min的速度离心10min；弃上清液，留取沉淀物，在沉淀物中加入70％冰乙醇洗涤2次，自然干燥；加入DEPC水，加入的DEPC水与取的细胞悬液的体积比为1：4；然后将产物置于‑20℃的环境中保存。