[发明专利]一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法

摘要

本发明涉及一种去磷酸化引发的转录反应介导的双信号扩增灵敏地检测碱性磷酸酶的方法，设计了一个5'‑磷酸化的T7启动子单链，碱性磷酸酶能够催化5'‑磷酸化的T7启动子去磷酸化，保护T7启动子链不被λ核酸外切酶消化，剩余的T7启动子能够激活T7RNA聚合酶介导的转录反应，从而产生大量的RNA转录物。随后，这些RNA转录物与Taqman探针互补配对形成RNA‑DNA双链体，引入双链特异性核酸酶引发Taqman探针的循环切割，从而产生明显增强的荧光信号。该方法操作简便，具有高灵敏度和很高的特异性，可以应用于复杂生物样品中的靶标抑制剂的筛选以及宫颈癌细胞中靶标的定量检测。

主权项

1.一种检测碱性磷酸酶的试剂盒，其特征在于：包括与碱性磷酸酶反应的双链DNA底物、Taqman探针、引发Taqman探针的循环切割的双链特异性核酸酶；所述双链DNA底物由5'‑磷酸化的T7启动子单链和模板双链体结合得到；优选的，所述试剂盒还包括双链特异性核酸酶缓冲液，所述缓冲液的组成为：50mmol/L的pH 8.0的Tris‑HCl，5mmol/L的氯化镁，1mmol/L的二硫苏糖醇；进一步优选的，Tris‑HCl、氯化镁、二硫苏糖醇的体积比为48‑52:3‑6:0.6‑1.4；优选的，所述试剂盒还包括5'‑磷酸化的T7启动子单链和模板双链体结合所用的Tris‑EDTA缓冲液和退火缓冲液；所述退火缓冲液为5mmol/L的pH 8.0的Tris‑HCl和50mmol/L的氯化钠；进一步优选的，退火缓冲液中Tris‑HCl和氯化钠的体积比为0.3‑0.7:3‑7。