[发明专利]橡子果液态发酵制备柠檬酸的方法

摘要

本发明公开了一种橡子果液态发酵制备柠檬酸的方法，该方法先将橡子粉用乙醇水溶液脱除酚类物质，减少橡子粉中发酵微生物抑制因子，提高淀粉的利用率；然后进行糊化、液化，调整液化液总糖含量后，添加豆腐黄浆水和甲醇，再接种驯化后的黑曲霉CICC 2716进行发酵，并在发酵过程中补充糖化酶，大大提高了橡子粉液化液发酵柠檬酸的产量；最后通过浓缩结晶、纯化等过程得到柠檬酸晶体。本发明方法简单，柠檬酸的产量高，提高了橡子粉的转化利用率，而且节约了时间成本及设备成本。

主权项

1.一种橡子果液态发酵制备柠檬酸的方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：(1)脱单宁橡子粉的制备收集无污染、霉变的成熟橡子果，自然晒干或在60～70℃的热风干燥机中烘干，用去壳机分离去除橡子壳后，粉碎果实，过60目筛网，得到橡子粉；将橡子粉与体积分数为60％～80％的乙醇水溶液按重量比为1∶5混合，充分搅拌60分钟，用三足式离心机离心，除去上清液，自然晒干或烘干，得到脱单宁橡子粗淀粉；(2)橡子粗淀粉的糊化向步骤(1)得到的脱单宁橡子粗淀粉中添加自来水，调整橡子粉浆含水量为75％～85％，将橡子粉浆在糊化罐中加热至90～100℃，保温糊化30分钟，糊化过程中不断搅拌；(3)α‑淀粉酶液化将步骤(2)糊化后的橡子粉浆冷却至55～65℃，用氢氧化钙调节pH值为6.0～6.5，加入酶活为3700U/g的α‑淀粉酶，α‑淀粉酶加入量为脱单宁橡子粗淀粉质量的0.8％～1.2％，在50～70℃保温液化，直至碘化钾试剂检测液化液的颜色不变为止，得到橡子粉液化液；(4)发酵菌种的活化和驯化将黑曲霉CICC 2716接种于PDA培养基上，28℃培养6～7天进行活化；将活化后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为18～22g/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中，在31℃下进行第一代驯化，培养时间为36小时；将第一代驯化后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为38～42g/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中，在31℃下进行第二代驯化，培养时间为36小时；将第二代驯化后的黑曲霉CICC 2716接种于柠檬酸含量为58～62g/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中，在31℃下进行第三代驯化，培养时间为36小时；将驯化三代后的黑曲霉CICC 2716接种于分离筛选平板上，28℃培养2～3天，所述的分离筛选平板向柠檬酸含量为45～55g/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中添加18～22g/L琼脂后形成；根据高产菌株的形态特征，从分离筛选平板上挑出单一菌落，分别移接于PDA斜面培养基上，28℃培养6～7天，孢子长好后，分别接入α‑萘酚含量为0.8～1.2mg/L、氯化铵含量为3～5g/L、可溶性固形物含量为14％～16％的橡子粉液化液中，31℃下培养60小时，筛选出柠檬酸产量高、糖转化率高且产酸稳定性强的菌种；(5)发酵培养基的配制取橡子粉液化液，调整其总糖含量为110～130g/L，然后加入橡子粉液化液体积2.5％～7.5％的豆腐黄浆水，用NaOH调节pH为5.5～6.0，在保温罐中95～100℃杀菌10分钟，冷却至常温后加入橡子粉液化液体积0.2％～0.4％的甲醇，得到发酵培养基；(6)黑曲霉发酵将步骤(4)筛选的菌株接种到PDA培养基上，28℃培养6～7天，用无菌水将培养基上孢子洗下，剧烈振荡，制成均匀的孢子悬液，孢子数达4.6～5.4×107个/mL；将步骤(5)得到的发酵培养基在无菌条件下加入发酵罐中，按接种量1.25％～3.75％接入孢子悬液，并在搅拌状态下通入无菌空气，保持发酵液中的溶氧量为0.35～0.45m3/(m3·min)，在31℃发酵36小时后，向发酵液中加入酶活为10000U/mg的糖化酶，糖化酶添加量为发酵培养基质量的0.0004％～0.0006％，继续发酵24小时，得到柠檬酸发酵醪；(7)柠檬酸的提取将柠檬酸发酵醪在75～90℃保持5分钟，采用加压式过滤机过滤，在滤液中加入过量碳酸钙粉末，80℃保持5分钟使柠檬酸钙沉淀出来，将沉淀用沸水洗涤2次后，在沉淀中加入2倍体积的蒸馏水，并在搅拌条件下加入0.15mol/L硫酸水溶液，80℃保温10分钟，趁热过滤得到酸解液；将酸解液分别通过粉状酸性活性炭柱、阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，得到精柠檬酸溶液；精柠檬酸溶液经过双效蒸发器减压浓缩，一效温度70～80℃，二效温度50～60℃，浓缩液在间歇式结晶器中于30～35℃下结晶得一水柠檬酸晶体，采用对流式干燥法在30℃下干燥，得到柠檬酸晶体。