[发明专利]一种土壤纤维素酶的测定方法

摘要

本发明涉及纤维素酶的测定方法，特别是涉及一种土壤纤维素酶的测定方法。本发明解决了现有土壤纤维素酶活性的测定方法普遍存在测量结果差异大、准确性低，效果不理想的缺陷；以及对于仪器的依赖性较大的问题。测定方法：一、土样加改进缓冲液和羧甲基纤维素溶液，培养；二、离心，上清液加3,5‑二硝基水杨酸，加热，冷却、测定吸光度值；三、制备无基质对照；无土壤对照；四、根据葡萄糖标准液的标准曲线计算出待测土样、无基质对照和无土壤对照的葡萄糖毫克数，再计算出待测土壤中纤维素酶的活性。本发明方法测定土壤纤维素酶活性具有平行性好，变异系数小，方法可行性高的优点。

主权项

1.一种土壤纤维素酶的测定方法，其特征在于土壤纤维素酶的测定方法按以下步骤进行：一、将采自田间的农田土风干，称取过筛的风干土样10.01～10.04g于50ml三角瓶中，用移液管准确加入甲苯1.5±1μl，放置14min～16min，然后加入pH6.0的改进缓冲液5ml±0.5ml，再加入羧甲基纤维素溶液5ml±1ml，再用保鲜膜将容器口封好，放置于37℃～38℃的环境中培养72～73h；二、制备无基质对照：称取过筛的风干土样10.01～10.04g于50ml三角瓶中，用移液管加入甲苯1.5±1μl，然后加入pH6.0的改进缓冲液5ml±0.5ml，放置14min～16min，然后加入蒸馏水5ml±1ml，再用保鲜膜将容器口封好，放置于37℃～38℃的环境中培养72～73h；无土壤对照：用移液管加入甲苯1.5±1μl，放置14min～16min；然后加入pH6.0的改进缓冲液5ml±0.5ml，再加入羧甲基纤维素溶液5ml±1ml，再用保鲜膜将容器口封好，放置于37℃～38℃的环境中培养72～73h；三、将经过培养的土样转移到离心管中，在转速3500～4000r/min下离心5min，再过滤上清液，取1mL～2mL滤液于50mL容量瓶中，加2.9mL～3.1mL 3,5‑二硝基水杨酸溶液，然后加水10mL～15mL，在沸水浴中加热5min，取出立即冷水浴中冷却至室温、定容，以空白管调零在波长540nm处测定吸光度值；四、根据葡萄糖标准液的标准曲线计算出待测土样、无基质对照和无土壤对照的葡萄糖毫克数，再计算出待测土壤中纤维素酶的活性；纤维素酶活性以每克烘干土样在72h内生成葡萄糖毫克数表示：纤维素酶活性＝(A－b－c)×n/mA为待测土样中葡萄糖毫克数、b为无土壤对照中葡萄糖毫克数、c为无基质对照中葡萄糖毫克数，n为分取倍数，m为烘干土重；所述改进缓冲液每升由12.10～12.14g三(羟甲基)氨基甲烷、11.60～11.64g顺丁烯二酸、14.00～14.10g柠檬酸一水化合物、6.30～6.34g硼酸、500～510mL浓度为1mol/L的NaOH溶液和余量的蒸馏水制成，并调节pH值至6.0；步骤三中3,5‑二硝基水杨酸溶液是在120～125ml水中加入1.25g二硝基水杨酸和50ml、浓度为1.95mol/L～2.05mol/L的NaOH溶液，二硝基水杨酸溶解后再加75g酒石酸钾钠并用水稀释至250ml。