[发明专利]分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株及构建方法

摘要

本发明公开了分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株及构建方法，其构建步骤为：1)宿主菌Kα的获得：安琪酿酒高活性干酵母进行生孢培养，筛选得到交配型为α型的单倍体菌株，用5‑氟乳清酸平板进行反选得到宿主菌Kα；2)纤维素酶基因表达盒定点整合质粒构建；3)酵母转化与筛选。本发明的方法能重复使用URA3筛选标记在酿酒酵母工业菌株之衍生菌株中实现多种纤维素酶基因的定点整合并分泌表达。本发明的重组菌株能有效提高商业化纤维素酶水解纤维素的效率，降低纤维素酶的生产成本，使木质纤维素资源高效转化生产乙醇。

主权项

1.分泌表达纤维素酶的酿酒酵母工业菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：1)宿主菌Kα的获得：安琪酿酒高活性干酵母进行生孢培养，筛选得到交配型为α型的单倍体菌株，用5‑氟乳清酸平板进行反选得到宿主菌Kα；2)纤维素酶基因表达盒定点整合质粒构建:将SEQ ID NO.1所示的DNA片断H1经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H1，再将SEQ ID NO.2所示的DNA片断H2经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H1的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU1；将SEQ ID NO.3所示的DNA片断H3经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H3，再将SEQ ID NO.4所示的DNA片断H4经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H3的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU2；将SEQ ID NO.5所示的DNA片断H5经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H5，再将SEQ ID NO.6所示的DNA片断H6经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H5的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU3；将SEQ ID NO.7所示的DNA片断H7经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H7，再将SEQ ID NO.8所示的DNA片断H8经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H7的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU4；将SEQ ID NO.9所示的DNA片断H9经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H9，再将SEQ ID NO.10所示的DNA片断H10经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H9的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU5；将SEQ ID NO.11所示的DNA片断H11经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H11，再将SEQ ID NO.12所示的DNA片断H12经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H11的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU6；将SEQ ID NO.13所示的DNA片断H13经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H13，再将SEQ ID NO.14所示的DNA片断H14经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H13的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU7；将SEQ ID NO.15所示的DNA片断H15经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H15，再将SEQ ID NO.16所示的DNA片断H16经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H15的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU8；将SEQ ID NO.17所示的DNA片断H17经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H17，再将SEQ ID NO.18所示的DNA片断H18经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H17的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU9；将SEQ ID NO.19所示的DNA片断H19经HindIII和PstI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR的HindIII‑PstI位点之间，得到质粒pUC18‑RYUR‑H19，再将SEQ ID NO.20所示的DNA片断H20经SmaI和EcoRI双酶切后插入质粒pUC18‑RYUR‑H19的SmaI‑EcoRI位点之间，构建得到定点整合质粒pUC18‑HRU10；将pUC18‑HRU1、pUC18‑HRU2、pUC18‑HRU3、pUC18‑HRU4、pUC18‑HRU5、pUC18‑HRU6、pUC18‑HRU7、pUC18‑HRU8、pUC18‑HRU9和pUC18‑HRU10分别用BamHI消化后，进行末端平滑化处理，分别得到载体片段V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9和V10；将质粒pGEM‑T easy‑Ptpi‑xyn2s‑ABGL1‑TadhI经XhoI和ScaI双酶切，得到的3.6kb DNA片断进行末端平滑化处理后与V1进行连接，得到纤维素酶基因表达盒定点整合质粒IP1；将质粒YEplac195‑Ptpi‑xyn2s‑TEGII‑TadhI经HindIII和EcoRI双酶切，得到的2.3kb DNA片断进行末端平滑化处理后分别与V2和V5进行连接，得到纤维素酶基因表达盒定点整合质粒IP2和IP5；将质粒pGEM‑T easy‑Ptpi‑xyn2s‑AEGI‑TadhI经PstI酶切，得到的1.8kb DNA片断进行末端平滑化处理后与V3进行连接，得到纤维素酶基因表达盒定点整合质粒IP3；将质粒pGEM‑T easy‑Ptpi‑xyn2s‑TCBHI‑TadhI经StuI和ScaI双酶切，得到的2.6kb DNA片断进行末端平滑化处理后分别与V4、V7和V10进行连接，得到纤维素酶基因表达盒定点整合质粒IP4、IP7和IP10；将质粒pGEM‑T easy‑Ptpi‑xyn2s‑ACBHI‑TadhI经MluI和ScaI双酶切，得到的2.8kb DNA片断进行末端平滑化处理后分别与V6和V8进行连接，得到纤维素酶基因表达盒定点整合质粒IP6和IP8；将质粒pGEM‑T easy‑Ptpi‑xyn2s‑TCBHII‑TadhI经StuI和ScaI双酶切，得到的2.6kb DNA片断进行末端平滑化处理后与V9进行连接，得到纤维素酶基因表达盒定点整合质粒IP9。3)酵母转化与筛选：将所述质粒IP1经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5‑氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα1；将所述质粒IP2经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα1，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5‑氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα2；将所述质粒IP3经PvuII酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα2，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5‑氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα3；将所述质粒IP5经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα3，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5‑氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα4；将所述质粒IP4经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα4，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5‑氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα5；将所述质粒IP7经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα5，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5‑氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα6；将所述质粒IP10经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα6，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5‑氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα7；将所述质粒IP9经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα7，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5‑氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα8；将所述质粒IP6经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα8，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5‑氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα9；将所述质粒IP8经ScaI酶切、核酸纯化后，采用醋酸锂法转化宿主菌Kα9，使用缺省尿嘧啶的基本培养基平板筛选转化子，再用5‑氟乳清酸平板进行反选得到去掉了URA3筛选标记的转化子Kα10。