[发明专利]中国小麦黄花叶病毒诱导的基因沉默载体的构建和应用在审
| 申请号： | 201810306401.8 | 申请日： | 2018-04-08 |
| 公开（公告）号： | CN108517332A | 公开（公告）日： | 2018-09-11 |
| 发明（设计）人： | 羊健;张恒木;彭琪琪;陈炫;何龙;杨锦;陈剑平 | 申请（专利权）人： | 浙江省农业科学院 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/82 |
| 代理公司： | 浙江一墨律师事务所 33252 | 代理人： | 鲁秦 |
| 地址： | 310021 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明主要涉及一种中国小麦黄花叶病毒诱导的基因沉默载体的构建及其在本氏烟中的应用。生物学活性分析显示构建的CWMV‑VIGS能够成功侵染本氏烟并对相关基因如八氢番茄红素脱氢酶、50S ribosomal protein L12等进行有效的转录后沉默，这不仅丰富了VIGS载体的种类，而且为基因功能的研究提供有效的技术手段。 | ||
| 搜索关键词： | 构建 基因沉默载体 病毒诱导 黄花叶 八氢番茄红素脱氢酶 生物学活性分析 小麦 转录 基因功能 技术手段 相关基因 侵染 应用 成功 研究 | ||
【主权项】：
1.一种中国小麦黄花叶病毒诱导的基因沉默载体的构建方法，包括以下步骤：1)引物设计：基于CWMV侵染性cDNA克隆的RNA2的突变体质粒pCB‑35S‑M5设计引物P1F/P1R，其中P1F的引物包含有SpeI、KpnI、MluI三个酶切位点，P1R的引物包含有SaII的酶切位点；2)扩增反应：以pCB‑35S‑M5的质粒为模板，采用高保真的Phusin DNA聚合酶进行扩增，其中引物对P1F/P1R扩增的PCR产物长约为550bp；3)pCB‑35S‑MCS突变体的构建：扩增的PCR产物进行切胶纯化回收后用SpeI/SaII进行双酶切，酶切产物经纯化后，连接至同样双酶切处理的pCB‑35S‑M5上，转化大肠杆菌，测序验证获得重组质粒pCB‑35S‑MCS。
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