[发明专利]一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的BTLA-/-T淋巴细胞的制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的BTLA^‑/‑T淋巴细胞的制备方法，该方法从肿瘤患者的外周血中分离得到T淋巴细胞，使用CRISPR‑Cas9技术，在体外将BTLA基因敲除，然后置于无血清培养基中培养，加入IFN‑γ、CD3单抗，IL‑2，IL‑1α，IL‑4，GM‑CSF和Puromycin，继续培养10～15天后，离心得到BTLA^‑/‑T淋巴细胞。本发明的BTLA^‑/‑T淋巴细胞的制备方法设计巧妙，制备得到的BTLA^‑/‑T淋巴细胞具有抵抗肿瘤免疫抑制微环境的特性，具有更佳的肿瘤杀伤效果，提高临床疗效，提供了新型的防癌治癌的手段。

主权项

1.一种抵抗肿瘤免疫抑制环境的BTLA‑/‑T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1.1设计并合成BTLA‑sgRNA序列；1.2构建BTLA‑sgRNA‑Cas9质粒，质粒含EF‑1α启动子驱动的人源化CAS9表达元件、人U6启动子驱动BTLA‑sgRNA表达元件以及PGK启动子驱动的PUROMYCIN抗性基因表达元件；1.3质粒的合成、验证和扩增；1.4将外周血细胞制备得到淋巴细胞和单核细胞；1.5制备得到CD3+T淋巴细胞；1.6将质粒转入CD3+T淋巴细胞；1.7将细胞放入含有2000IU/mL的IFN‑γ的X‑VIVO15培养基中，37℃，5％二氧化碳培养24h；1.8然后加入20μg/mL的CD3单抗、500IU/mL IL‑2、50ng/mL IL‑1α、100ng/mL IL‑4、2000IU/mL GM‑CSF、5μg/mL Puromycin；1.9培养3～5天后，添加500IU/mL IL‑2的新鲜培养基，细胞浓度保持在1～2x106/mL；每隔2～3天对细胞进行计数，并添加含500IU/mL IL‑2的新鲜培养基，继续培养10～15天，收获细胞，即为BTLA‑/‑T淋巴细胞制剂。