[发明专利]一种将TLR9应用于治疗冠状动脉粥样硬化的研究方法

摘要

一种将TLR9应用于治疗冠状动脉粥样硬化的研究方法，本发明涉及医疗技术领域；研究对象及分组；血标本采集；指标检测：心脏超声；冠心病患者术前、术后、无冠心病者一次心肌酶、CRP、BNP检测；冠心病患者术前术后、无冠心病者一次TLR9检测；统计学分析。通过用RT‑PCR检测冠心病患者和健康者外周血单核细胞中TLR9 mRNA的表达水平，明确TLR9与冠心病及其预后有无关系并进一步分析是怎样的关系，经皮冠脉介入治疗对TLR9表达的影响，为冠心病治疗确立新的靶点。

主权项

1.一种将TLR9应用于治疗冠状动脉粥样硬化的研究方法，其特征在于：它从人体实验方面进行研究分析，所述的人体实验的研究步骤如下：(1)、研究对象及分组：2017年4月‑2019年6月医院心内科住院病人，共人选150例经临床和造影诊断为冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者，其诊断根据典型的临床表现、心肌酶学、心电图、冠脉造影等指标，符合世界卫生组织关于冠心病的诊断标准；其中急性心肌梗死组50例；稳定性心绞痛组50例；不稳定性心绞痛组50例；正常对照组：共入选50例无冠心病者，无既往冠心病史，血常规、血脂、肝肾功能指标均正常，无其他自身免疫性疾病及感染性疾病表现；(2)、血标本采集：冠心病入选者在PCI术前和术后，无冠心病者任何时间点空腹采集静脉血3ml，1：9的枸橼酸钠抗凝；(3)、指标检测：(3.1)、心脏超声：冠心病组每个病人术前术后各做一次心脏心脏超声，无冠心病者也行一次心脏超声检查；(3.2)、冠心病患者术前、术后、无冠心病者一次心肌酶、CRP、BNP检测；(3.3)、冠心病患者术前术后、无冠心病者一次TLR9检测；(3.3.1)、分离PBMCs和制备细胞总RNA所有人选者空腹采集静脉血3ml，以1：9的枸橼酸钠抗凝，加入等体积生理盐水稀释后，以2ml的淋巴细胞分离液按密度梯度离心法分离单个核细胞；收集细胞沉淀，提取细胞总RNA，操作严格按照试剂公司的细胞总RNA抽提试剂盒的说明书进行；分别通过1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪，检测所得总RNA的质量和浓度；(3.3.2)、cDNA的合成RNA+DEPC水：11μl，RNA量1‑5μg；Oligle dT：1μl；70℃放置5min，冰上放置5min；5×RTase Buffer：4μl；Rnase Inhibitor：1μl，dNTP：2μl，37℃放置5min；RTase：1μl，42℃放置70min，70℃放置10min；所得cDNA‑20℃冻存备用；(3.3.3)、qRT‑PCR取0.2ml薄壁PCR管，分别编号；向各管中加入2×qPCR TaqMix 12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，对应的cDNA各1ul；一管中不加模板用作阴性对照；各管补加水至25ul；PCR反应混匀，置于Roche 480荧光定量PCR仪中；95℃5min预变性后，95℃15s，65℃35s，40循环；(4)、统计学分析：各数据以均数±标准差表示，组间比较首先行方差齐性检验，方差不齐，使用非参数检验，方差齐采用方差分析，采用SPSS23统计软件对实验数据进行统计学处理；P≤0.05为差异有统计学意义。