[发明专利]乌龟血清对人肺癌细胞抑制作用的应用

摘要

本发明公开了乌龟血清对人肺癌细胞抑制作用的应用，属于生物化学技术领域；包括以下步骤：(1)提取乌龟血清；(2)CCK‑8法测定乌龟血清对肺癌肿瘤细胞增殖的影响；(3)DAPI染色检测细胞核形态变化；(4)Western bloting检测AKT/mTOR/S6磷酸化情况；(5)Annexin V‑FITC/PI检测细胞凋亡率。本发明的有益效果：本发明的数据建立在乌龟血清对多种肿瘤细胞具有非常明显的体外增殖抑制活性，其中对人肺癌肿瘤细胞增殖抑制较强的基础之上。

主权项

1.乌龟血清对人肺癌细胞抑制作用的应用，其特征在于，步骤如下：(1)提取乌龟血清：无菌条件下于乌龟心脏采血，室温静置2h彻底凝固后，3000r/min，离心20min，分离血清，56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置‑20℃条件下低温保存，备用，使用前用DMEM培养液分别配置成含有1％、5％和10％乌龟血清的DMEM细胞培养液；(2)CCK‑8法测定乌龟血清对人肺癌肿瘤细胞增殖的影响：将对数生长期的肺癌肿瘤细胞浓度调整为1×104个/mL，加入96孔板中，100μL/孔，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃上清，分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的DMEM细胞培养液，每个浓度设6个复孔，以含有10％小牛血清的DMEM细胞培养液为对照实验，继续培养24h，CCK‑8法测定450nm纳米处吸光度OD值，重复实验三次，记录下平均数据；(3)DAPI染色检测细胞核形态变化：把处于对数生长期的肺癌肿瘤细胞接种于6孔板，密度约2×108/L，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，将细胞分为空白对照组和实验组，实验组中分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的DMEM细胞培养液，以含有10％小牛血清的DMEM细胞培养液为对照组，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h后用PBS洗清多次，避光条件下用质量浓度为1mg/L的DAPI染色3min，染色结束后再用PBS避光条件下清洗多次，将染色清洗处理好的细胞放置在荧光显微镜下观测和拍照分析；(4)Western bloting检测AKT/mTOR/S6磷酸化情况：提前24h把对数生长期的肺癌肿瘤细胞接种于6孔板，密度约2×108/L，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，将细胞分为空白对照组和实验组，实验组中分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的DMEM细胞培养液，以含有10％小牛血清的DMEM细胞培养液为对照组，培养24h后，每孔加入150μL细胞裂解液，在冰上裂解40min，然后加入150μL 2×SDS Loading buffer的十二烷基硫酸钠蛋白上样缓冲液，水浴煮沸5min，再依次使用质量浓度为5％的浓缩胶和质量浓度为10％的分离胶进行SDS‑PAGE蛋白电泳，转膜至PVDF膜上，最后用质量浓度为5％脱脂牛奶溶液封闭1h，孵育一抗4℃过夜，荧光二抗孵育1h，使用胶片曝光进行成像；(5)Annexin V‑FITC/PI检测细胞凋亡率：提前24h把对数生长期的肺癌肿瘤细胞接种于6孔板，密度约2×108/L，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，将细胞分为空白对照组和实验组，实验组中分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的DMEM细胞培养液，以含有10％小牛血清的DMEM细胞培养液为对照组，培养24h后，使用质量分数为0.25％的胰酶消化，消化后在800r/min的转速下离心3min收集细胞样品，然后使用提前预冷过的PBS清洗多次，清洗处理后采用AnnexinV‑FITC/PI试剂盒再处理细胞样品，然后用流式细胞仪上机检测和数据分析，每次计数1×104个细胞。