[发明专利]一种重组Vip3 Aa蛋白的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及一种重组Vip3 Aa蛋白的制备方法及其应用，属于生物防治领域。本发明所述的重组Vip3 Aa蛋白的制备方法通过将Vip3 Aa DNA进行PCR反应后，然后使用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切得到目的基因并与pET21b连接得到Vip3 Aa/pET21b表达载体，将载体转入E.coil BL21感受态细胞得到重组菌株，重组菌株生长至对数生长期后加入IPTG诱导表达制备得到Vip3 Aa蛋白，该蛋白对于德国小蠊和美洲大蠊具有很好的生物防治效果，适合在农业上推广应用。

主权项

1.一种重组Vip3 Aa蛋白的制备方法，其具体包括下述步骤：1)Vip3 Aa基因的克隆：以Vip3 Aa DNA为模板，参考序列GenBank：L48811.1，Bacillus thuringienis strain AB88 insecticidal protein设计引物进行PCR反应，引入BamH I和Xho I酶切位点；2)Vip3 Aa/pET21b表达载体的构建和鉴定：将PCR产物和原核表达质粒pET21b分别采用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，采用DNA纯化回收试剂盒回收酶切片段，全波长分光光度计检测回收产物浓度并计算酶切片段摩尔数，以目的基因：表达载体摩尔比为3：1，通过T4连接酶进行连接反应构建得到Vip3 Aa/pET21b表达载体；3)Vip3 Aa/pET21b/BL21重组菌株的获得向100μL E.coil BL21感受态中加入10μL提取鉴定为阳性的Vip3 Aa/pET21b表达载体，轻弹混匀后冰上放置30min，金属浴42℃下热击90s，冰上放置1min后向其中加入900μlLB培养基，37℃下低速振荡培养1h‑1.5h；5000rpm离心去上清，将沉淀使用200μL LB培养基吹打均匀，均匀涂布于氨苄筛选平板；连续培养16‑18h后，挑取单菌落进行菌落PCR和酶切鉴定获得Vip3 Aa/pET21b/BL21重组菌株；4)重组菌株的诱导表达挑取Vip3 Aa/pET21b/BL21重组菌株单菌落接种于5ml含有100μg/ml氨苄的LB液体培养基中，37℃180rpm条件下震荡培养12‑16h，将此菌液按1：100的比例接种于新鲜的LB液体培养基中，37℃180rpm条件下震荡培养至OD600值为0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，20℃，180rpm条件下继续震荡培养24h；5)Vip3 Aa蛋白的分离纯化和冷冻干燥将诱导表达的Vip3 Aa/pET21b/BL21重组菌株12000rpm离心10min，收集菌体，PBS洗涤离心；按每升培养液加入40mL比例加入裂解缓冲液(25mmol·L‑1Tris‑Cl，300mmol·L‑1NaCl，5mmol·L‑1β‑巯基乙醇，pH8.0)悬浮菌体，加入PMSF和1％曲拉通X‑100，采用超声细胞破碎仪破碎12min，细胞破碎后，12000rpm离心30min，取上清进行SDS‑PAGE；Vip3 Aa/pET21b菌株破碎后上清液采用0.22μM滤器过滤，吸取10ml Vip3 Aa/pET21b菌株破碎后上清液上层析柱，采用五倍柱体积的2％咪唑的Blinding buffer对层析柱进行平衡，然后进行线性梯度洗脱；Vip3 Aa蛋白脱盐及冷冻干燥：将脱盐柱和层析系统相连，以4ml/min去离子水冲洗5个柱体积，5倍柱体积的0.15M NaCl缓冲液对层析柱进行平衡，采用2ml上样环上样，采用脱盐程序脱盐，收集脱盐的样品溶液，置于‑80℃冷冻2h，冷冻干燥仪预冷至‑40℃，冷冻干燥48h即得Vip3 Aa蛋白。