[发明专利]一种蓖麻遗传转化方法

摘要

本发明属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种蓖麻遗传转化方法，包括如下步骤：制备转化受体、制备侵染液、侵染、共培养、恢复培养、筛选、伸长生根培养，得到蓖麻的带有卡纳抗性基因蓖麻遗传转化植株。本方法过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的蓖麻转基因植株。

主权项

1.一种蓖麻遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)制备转化受体蓖麻种子的灭菌：剥掉蓖麻种皮，在锥形瓶中用75％的乙醇灭菌5min，之后用15％的过氧化氢于摇床100rpm震荡处理15min，最后用无菌水清洗5次；预培养：取种子的白色胚乳，放置于Rc1培养基中，暗处培养5天至生根发芽，将根和子叶部分切掉后放置于Rc2培养基中，再将Rc2培养基放在超净工作台上，光照培养3‑7天，至外植体变粗变绿；2)制备侵染液取20ml Rc‑inf，依次加入20μl AS、10μl DTT、10μl Na2SO3，将农杆菌挑至混合液中，制成侵染液；3)侵染将Rc2培养基中的蓖麻放置于超净工作台中，用刀在外植体原两片子叶打开的地方切一下，刀口不超过0.2cm，取50ml的灭菌三角瓶，向其中倒入Rc‑inf，没过瓶底即可，将切好的外植体放入三角瓶中，再将步骤2)制备的侵染液加至三角瓶中，于摇床100rpm侵染15min，之后取出置于无菌滤纸上吹20min；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的外植体接至放有灭菌滤纸的Rc‑cocu培养基上，暗处培养3天；5)恢复培养将共培养后的外植体取出放置于灭菌皿中，观察切痕处是否变黑，变黑即放入Rc‑reco培养基中恢复培养5～10天，当外植体变粗并长出绿色叶子时将其转接入筛选培养基；6)筛选将恢复培养完毕的外植体放入筛选培养基Rc3‑Bas2中筛选，筛选过程一次10天，筛选2‑3次，至外植体逐渐膨大并在顶端长出新芽，得到转化外植体；7)伸长、生根培养将转化外植体放置于Rc3培养基中进行伸长，伸长过程一次10天，伸长2‑4次；将伸长至2～3cm的小苗取出，切掉底部愈伤化或黑化部分，再接入Rc4培养基进行生根；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：